The Role of Raf-1 and B-Raf in B cell activation, differentiation, and tumorigenesis in mice

Scheffler, Laura (2023): The Role of Raf-1 and B-Raf in B cell activation, differentiation, and tumorigenesis in mice. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

B cells are part of the adaptive immune system and, as plasma cells, fight various path-ogens by producing antibodies. The development, homeostasis, and self-tolerance of B cells are regulated by several key cellular processes. These cellular key functions, as proliferation, differentiation, but also apoptosis and cell cycle arrest are controlled by different signaling pathways. One major regulator of these processes is the extracellular signal–regulated kinase (ERK), which is mainly activated by the mitogen-activated pro-tein kinase (MAPK) pathway Ras-Raf-MEK-ERK. In B cells, the contribution of the Ras-Raf-MEK-ERK signaling pathway to B cell development, activation, differentiation, and transformation was described by the analyses of the components Ras and ERK in different cell lines. To investigate the role of the Raf-kinases on these processes specifically in primary murine B cells, Raf-1fl/fl//B-Raffl/fl//mb1-Cre+/- (DKO) mice were generated leading to the B cell specific deletion of the two kinases from the early B cell development onwards. This mouse model was used within this thesis to analyze Raf mediated functions during B cell development, activation, and differentiation. Within this dissertation, important roles of B-Raf and Raf-1 in the following processes was revealed: (I) B-Raf and Raf-1 were not required to mediate ERK phosphorylation in BCR, LPS and CD40 stimulated B cells but rather acted as negative regulators of PI3K or Rac/PAK mediated ERK phos-phorylation in resting and activated mature B cells. (II) Inactivation of B-Raf and Raf-1 in DKO mice resulted in an impaired T independent immune response. (III) B-Raf//Raf-1 inactivation caused a block in plasma cell differentiation at the transition of activated B cells to pre-plasmablasts and in their further differentiation into plasmablasts. We found that at this stages B-Raf and Raf-1 mediate a strong increase in ERK phosphorylation, which seemed to be essential for plasma cell differentiation. Furthermore, Raf-1fl/fl//B-Raffl/fl//LMP1/CD40flSTOP+/-//CD19-Cre+/- (RafDKO/LC40) mice were compared with LMP1/CD40flSTOP+/-//CD19-Cre+/- (LC40) and control mice to ex-amine the effect of the genetic inactivation of B-Raf and Raf-1 on B cells with a consti-tutively active CD40 signal and the resulting LC40 driven B cell transformation. Inactiva-tion of B-Raf and Raf-1 in RafDKO/LC40 mice decreased the LC40 mediated pheno-type of B and T cell expansion and B cell transformation. As revealed by an RNA-Seq analysis, this appeared to be predominantly caused by decreased LC40 mediated Myc expression, and reduced Notch2 and non-canonical NFκB activation. These data, sug-gest that Raf-kinases modulate the activation of these two signaling pathways down-stream of CD40.

Abstract

B-Zellen sind Teil des adaptiven Immunsystems und bekämpfen als Plasmazellen durch Antikörperproduktion verschiedene Krankheitserreger. Die Entwicklung, Homöo-stase und Selbsttoleranz von B-Zellen werden durch mehrere zelluläre Schlüsselpro-zesse reguliert. Diese umfassen Proliferation, Differenzierung, aber auch Apoptose und Zellzyklusarrest und werden durch verschiedene Signalwege gesteuert. Ein wichtiger Regulator dieser Prozesse ist die extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK), die hauptsächlich durch den Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Signalweg Ras-Raf-MEK-ERK aktiviert wird. In B-Zellen wurde der Beitrag des Ras-Raf-MEK-ERK-Signalwegs zur Entwicklung, Aktivierung, Differenzierung und Transformation von B-Zellen durch die Analyse der Komponenten Ras und ERK in verschiedenen Zelllinien beschrieben. Um die Rolle der Raf-Kinasen auf diese Prozesse speziell in primären murinen B-Zellen zu untersuchen, wurden Raf-1fl/fl//B-Raffl/fl//mb1-Cre+/- (DKO)-Mäuse erzeugt. Diese weisen eine B-Zell-spezifischen Deletion der beiden Kinasen ab der frühen B-Zell-Entwicklung auf. Dieses Mausmodell wurde in dieser Arbeit verwendet, um die Raf-vermittelten Funktionen während der B-Zellentwicklung, -aktivierung und -differenzierung zu analysieren. Im Rahmen dieser Dissertation wurden wichtige Rollen von B-Raf und Raf-1 in den folgenden Prozessen aufgedeckt: (I) B-Raf und Raf-1 wa-ren nicht erforderlich, um die ERK-Phosphorylierung in BCR-, LPS- und CD40-stimulierten B-Zellen zu vermitteln, sondern fungierten vielmehr als negative Regulato-ren der PI3K- oder Rac/PAK-vermittelten ERK-Phosphorylierung in ruhenden und akti-vierten reifen B-Zellen. (II) Die Inaktivierung von B-Raf und Raf-1 in DKO-Mäusen führ-te zu einer beeinträchtigten T-Zell unabhängigen Immunantwort. (III) Die B-Raf//Raf-1-Defizienz verursachte eine Blockade der Plasmazell-Differenzierung beim Übergang von aktivierten B-Zellen zu Prä-Plasmablasten und bei ihrer weiteren Differenzierung zu Plasmablasten. Wir fanden heraus, dass B-Raf und Raf-1 in diesen Stadien einen star-ken Anstieg der ERK-Phosphorylierung bewirken, der für die Plasmazell-Differenzierung wesentlich zu sein scheint. Darüber hinaus wurden Raf-1fl/fl//B-Raffl/fl//LMP1/CD40flSTOP+/-//CD19-Cre+/- (RafD-KO/LC40)-Mäuse mit LMP1/CD40flSTOP+/-//CD19-Cre+/- (LC40)- und Kontrollmäusen verglichen, um die Auswirkungen einer genetischen Inaktivierung von B-Raf und Raf-1 auf B-Zellen mit einem konstitutiv aktiven CD40-Signal und die daraus resultierende LC40-getriebene B-Zelltransformation zu untersuchen. Die Inaktivierung von B-Raf und Raf-1 in RafDKO/LC40-Mäusen verringerte den LC40-vermittelten Phänotyp der B- und T-Zell-Expansion sowie der B-Zelltransformation. Wie eine RNA-Seq-Analyse ergab, scheint dies in erster Linie auf eine verringerte LC40-vermittelte Myc-Expression und eine reduzierte Notch2- und nichtkanonische NFκB-Aktivierung zurückzuführen zu sein. Diese Daten deuten darauf hin, dass Raf-Kinasen die Aktivierung dieser beiden Signalwege stromabwärts von CD40 modulieren.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Raf-kinases, B-cells, mice, signalling
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 11. Oktober 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Zimber-Strobl, Ursula