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Einfluss freier Sauerstoffradikale auf das Zellvolumen von Gliazellen
Einfluss freier Sauerstoffradikale auf das Zellvolumen von Gliazellen
Das zytotoxische Hirnödem ist eine wichtige Manifestation des zerebralen Sekundärschadens nach zerebraler Ischämie und Schädel-Hirn-Trauma. Der Analyse von Schwellungs- und Schädigungsmechanismen auf zellulärer Ebene in vivo ist durch die Komplexität der zeitgleich ablaufenden Ereignisse enge Grenzen gesetzt. Für die vorliegenden Experimente wurde deswegen ein in vitro Modell verwendet, welches die Untersuchung von C6-Gliomzellen als Einzelzellsuspension unter definierten und kontrollierten Bedingungen bei Veränderung verschiedener Parameter erlaubt. In den letzten Jahren konnten am Institut für Chirurgische Forschung anhand dieses Modells einige Mediatoren des zytotoxischen Ödems in vitro identifiziert werden. Die vorliegende Arbeit ist eine Fortsetzung der durchgeführten Untersuchungen zur Aufklärung der Mechanismen der zytotoxischen Zellschwellung. Sie befasst sich mit der Frage, welchen Einfluß freie Sauerstoffradikale (ROS) auf das Zellvolumen und die Zellvitalität von C6-Gliazellen in vitro haben. Freie Sauerstoffradikale werden unter akuten pathologischen Bedingungen vermehrt im Gehirn freigesetzt. Sie erzeugen durch ihre starke Reaktionsfähigkeit vielfältige pathophysiologische Wirkungen im Gehirn, die zur Zerstörung von Zellmembranen, Oxidation zellulärer Strukturen und DNS-Strangbrüchen führen. Für die Analyse des im Mittelpunkt stehenden Parameters Zellvolumen wurde die Durchflußzytometrie eingesetzt. Die Vitalität der Zellen wurde anhand der Trypanblau-Ausschlußmethode ermittelt. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde der Einfluß von Wasserstoffperoxid (H2O2) auf das Volumen und die Vitalität von C6-Gliomzellen untersucht. Die Zellvolumenänderung von C6-Gliomzellen durch H2O2 unterliegt einer Dosis-Wirkungsbeziehung. 0,1 mM H2O2 bewirkte über den Beobachtungszeitraum von 120 Minuten keine Volumenänderung. Ab einer Endkonzentration von 0,5 mM H2O2 kam es zu einer raschen Zellvolumenabnahme. Es folgten biphasische Verläufe der Volumenänderungen unter 0,5, 1,0 und 5,0 mM H2O2. Das Zellvolumen erreichte nachfolgend das Ausgangzellvolumen. Unter der Applikation von 5,0 mM H2O2 kam es in der zweiten Stunde des Beobachtungszeitraumes zu einer signifikanten Zellschwellung. 84 In weiteren Versuchen induzierten wir oxidativen Stress extrazellulär durch das Enzym Xanthinoxidase mit dem Substrat Hypoxanthin (HX/XOD) in den Enkonzentrationen 1 mM HX, 10 oder 20 mU/ml. HX/XOD provozierte in beiden Versuchsreihen eine prompte Abnahme des Zellvolumens auf Werte um 90% des Ausgangszellvolumens. Das Zellvolumen zeigte während des Beobachtungszeitraumes keine Rückregulation, wie in den Versuchen mit H2O2. XOD 10 mU/ml ohne HX zeigte einen ähnlichen Verlauf der Volumenänderung. Die Applikation von HX alleine bewirkte keine Volumenänderung. Mit dem Pharmakon Menadion (MQ), das Zellmembranen passieren kann, induzierten wir oxidativen Stress intrazellulär. Menadion wurde in den Enkonzentrationen 25 und 50 µM verwendet. Während nach Applikation von 25 µM Menadion keine Volumenänderung bei C6-Gliomzellen zu verzeichnen war, provozierte 50 µM Menadion eine signifikante Zellschrumpfung nach einer Latenzphase von 100 Minuten. Eine extrazelluläre Laktatazidose von 6,8 führte, wie bereits bekannt, zu einer Schwellung von C6-Gliomzellen auf 115% des Ausgangswertes. Die Zellvitalität blieb unverändert. In Kombination mit oxidativem Stress mittels HX/XOD 1/10 mM/mU/ml, zeigte sich eine dazu spiegelbildlich verlaufende Zellschrumpfung. Offensichtlich hemmen freie Radikale demnach die Mechanismen die zur azidoseinduzierten Zellschwellung führen, wie z.B. den Na+/H+-Antiporter. Diese Annahme haben wir mit dem Na+/H+-Inhibitor Amilorid bestätigt. Die radikalinduzierte Zellvolumenänderung konnte mit Amilorid fast vollständig gehemmt werden. Die Vitalität der C6-Gliomzellen zeigte in keiner der Versuchreihen eine Abnahme über den gesamten Beobachtungszeitraum. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass freie Sauerstoffradikale in vitro zu einer Schrumpfung von C6-Gliomzellen führen. Die Ergebnisse legen somit den Schluß nahe, dass freie Sauerstoffradikale nicht an der Pathogenese des zytotoxischen Hirnödems beteiligt sind. Freie Sauerstoffradikale sind allerdings in der Lage, die Clearence-Funktion von Gliazellen zu stören. So konnten ROS die Aufnahme von H+-Ionen (zusammen mit der konsekutiven Aufnahme von Na+-Ionen) und die daraus folgende kompensatorische Zellschwellung hemmen. Freie Radikale scheinen also nicht direkt toxisch zu wirken, sondern über die Hemmung Astrozyten-vermittelter neuroprotektiver Mechanismen, wie z.B. die Clearence von H+ aus dem Extrazellulärraum. Weitere Untersuchungen müssen diesen Anfangsverdacht im Detail klären.
Hirnödem, Zytotoxisches Hirnödem, Gliazellen, Astrozyten, Freie Radikale
Bieringer, Frank
2005
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Bieringer, Frank (2005): Einfluss freier Sauerstoffradikale auf das Zellvolumen von Gliazellen. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Das zytotoxische Hirnödem ist eine wichtige Manifestation des zerebralen Sekundärschadens nach zerebraler Ischämie und Schädel-Hirn-Trauma. Der Analyse von Schwellungs- und Schädigungsmechanismen auf zellulärer Ebene in vivo ist durch die Komplexität der zeitgleich ablaufenden Ereignisse enge Grenzen gesetzt. Für die vorliegenden Experimente wurde deswegen ein in vitro Modell verwendet, welches die Untersuchung von C6-Gliomzellen als Einzelzellsuspension unter definierten und kontrollierten Bedingungen bei Veränderung verschiedener Parameter erlaubt. In den letzten Jahren konnten am Institut für Chirurgische Forschung anhand dieses Modells einige Mediatoren des zytotoxischen Ödems in vitro identifiziert werden. Die vorliegende Arbeit ist eine Fortsetzung der durchgeführten Untersuchungen zur Aufklärung der Mechanismen der zytotoxischen Zellschwellung. Sie befasst sich mit der Frage, welchen Einfluß freie Sauerstoffradikale (ROS) auf das Zellvolumen und die Zellvitalität von C6-Gliazellen in vitro haben. Freie Sauerstoffradikale werden unter akuten pathologischen Bedingungen vermehrt im Gehirn freigesetzt. Sie erzeugen durch ihre starke Reaktionsfähigkeit vielfältige pathophysiologische Wirkungen im Gehirn, die zur Zerstörung von Zellmembranen, Oxidation zellulärer Strukturen und DNS-Strangbrüchen führen. Für die Analyse des im Mittelpunkt stehenden Parameters Zellvolumen wurde die Durchflußzytometrie eingesetzt. Die Vitalität der Zellen wurde anhand der Trypanblau-Ausschlußmethode ermittelt. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde der Einfluß von Wasserstoffperoxid (H2O2) auf das Volumen und die Vitalität von C6-Gliomzellen untersucht. Die Zellvolumenänderung von C6-Gliomzellen durch H2O2 unterliegt einer Dosis-Wirkungsbeziehung. 0,1 mM H2O2 bewirkte über den Beobachtungszeitraum von 120 Minuten keine Volumenänderung. Ab einer Endkonzentration von 0,5 mM H2O2 kam es zu einer raschen Zellvolumenabnahme. Es folgten biphasische Verläufe der Volumenänderungen unter 0,5, 1,0 und 5,0 mM H2O2. Das Zellvolumen erreichte nachfolgend das Ausgangzellvolumen. Unter der Applikation von 5,0 mM H2O2 kam es in der zweiten Stunde des Beobachtungszeitraumes zu einer signifikanten Zellschwellung. 84 In weiteren Versuchen induzierten wir oxidativen Stress extrazellulär durch das Enzym Xanthinoxidase mit dem Substrat Hypoxanthin (HX/XOD) in den Enkonzentrationen 1 mM HX, 10 oder 20 mU/ml. HX/XOD provozierte in beiden Versuchsreihen eine prompte Abnahme des Zellvolumens auf Werte um 90% des Ausgangszellvolumens. Das Zellvolumen zeigte während des Beobachtungszeitraumes keine Rückregulation, wie in den Versuchen mit H2O2. XOD 10 mU/ml ohne HX zeigte einen ähnlichen Verlauf der Volumenänderung. Die Applikation von HX alleine bewirkte keine Volumenänderung. Mit dem Pharmakon Menadion (MQ), das Zellmembranen passieren kann, induzierten wir oxidativen Stress intrazellulär. Menadion wurde in den Enkonzentrationen 25 und 50 µM verwendet. Während nach Applikation von 25 µM Menadion keine Volumenänderung bei C6-Gliomzellen zu verzeichnen war, provozierte 50 µM Menadion eine signifikante Zellschrumpfung nach einer Latenzphase von 100 Minuten. Eine extrazelluläre Laktatazidose von 6,8 führte, wie bereits bekannt, zu einer Schwellung von C6-Gliomzellen auf 115% des Ausgangswertes. Die Zellvitalität blieb unverändert. In Kombination mit oxidativem Stress mittels HX/XOD 1/10 mM/mU/ml, zeigte sich eine dazu spiegelbildlich verlaufende Zellschrumpfung. Offensichtlich hemmen freie Radikale demnach die Mechanismen die zur azidoseinduzierten Zellschwellung führen, wie z.B. den Na+/H+-Antiporter. Diese Annahme haben wir mit dem Na+/H+-Inhibitor Amilorid bestätigt. Die radikalinduzierte Zellvolumenänderung konnte mit Amilorid fast vollständig gehemmt werden. Die Vitalität der C6-Gliomzellen zeigte in keiner der Versuchreihen eine Abnahme über den gesamten Beobachtungszeitraum. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass freie Sauerstoffradikale in vitro zu einer Schrumpfung von C6-Gliomzellen führen. Die Ergebnisse legen somit den Schluß nahe, dass freie Sauerstoffradikale nicht an der Pathogenese des zytotoxischen Hirnödems beteiligt sind. Freie Sauerstoffradikale sind allerdings in der Lage, die Clearence-Funktion von Gliazellen zu stören. So konnten ROS die Aufnahme von H+-Ionen (zusammen mit der konsekutiven Aufnahme von Na+-Ionen) und die daraus folgende kompensatorische Zellschwellung hemmen. Freie Radikale scheinen also nicht direkt toxisch zu wirken, sondern über die Hemmung Astrozyten-vermittelter neuroprotektiver Mechanismen, wie z.B. die Clearence von H+ aus dem Extrazellulärraum. Weitere Untersuchungen müssen diesen Anfangsverdacht im Detail klären.