TGFβ differentially specifies T follicular helper versus Th17 cell fates of murine CD4+ T cells

Chang, Yinshui (2023): TGFβ differentially specifies T follicular helper versus Th17 cell fates of murine CD4+ T cells. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

The generation of high-affinity antibodies is of most importance for the clearance of pathogens and the efficacy of vaccines. Potent antibody responses require interactions between B cells and T follicular helper (Tfh) cells, which are specialized in providing cognate help to B cells. However, despite Tfh cells being first described in the year 2000, no robust and reliable protocol is available for in vitro Tfh cell differentiation of murine CD4+ T cells. In this thesis, we challenged the longstanding theory of the inhibitory effect of TGFβ on murine Tfh cell differentiation, by identifying TGFβ as a critical driver of murine Tfh cell differentiation in vitro. TGFβ was required to initiate CXCR5 protein expression, the characteristic chemokine receptor expressed by Tfh cells, and to aid in its maintenance. By going against the common practice of including a TGFβ-neutralizing antibody into murine Tfh cell cultures, we first established a robust and reproducible in vitro protocol to generate Tfh cells from naïve mouse CD4+ T cells with plate-bound anti-CD3 and anti-CD28 stimulation. The in vitro TGFβ-induced CXCR5+ T cell population exhibited transcriptional and functional features of in vivo-generated Tfh cells. The TGFβ signaling pathway was biologically relevant, as the disruption of this pathway by knockout of the TGFβ receptor significantly reduced CXCR5 expression and also reduced the Tfh cell population in an in vivo immunization setting. An important optimization step of the Tfh cell culture was the reduction of cell density, which reduced paracrine IL-2 signaling, thereby strongly enhancing Tfh cell differentiation. Tfh and Th17 cells show substantial plasticity between the two T helper subsets. Interestingly, we next discovered that in the in vitro model system a mixture of both Tfh-like and Th17-like cells were generated. To identify potential transcription factors that drive the divergence between Tfh and Th17 cells, we performed bulk RNA-seq analyses of sorted Tfh and Th17 cells. We next analyzed a selection of promising targets in an arrayed CRISPR/Cas9 screen and identified c-Maf as a transcription factor regulating Tfh versus Th17 cell fate as a molecular switch. Ablation of Maf strongly shifted the balance from Tfh towards Th17 cells. Finally, we confirmed in an acute LCMV setting that c-Maf also regulated Tfh versus Th17 differentiation in vivo. Taken together, we established a robust and reproducible in vitro protocol to differentiate murine Tfh cells. This protocol provides a versatile platform for studying Tfh cell differentiation and plasticity in more detail. By using this culture, we identified c-Maf driving the divergent differentiation of Tfh and Th17 cells. We also debunked the longstanding concept of the inhibitory effect of TGFβ on murine Tfh cells. Since TGFβ can also induce human Tfh cells, our data indicate that human and mouse Tfh biology may actually be closer related than previously believed.

Abstract

Die Produktion von hochaffinen Antikörpern ist von großer Bedeutung sowohl für die Abwehr von Krankheitserregern als auch für die Wirksamkeit von Impfungen. Eine effektive Antikörperantwort erfordert das Zusammenspiel von B-Zellen und follikulären T-Helfer (Tfh)-Zellen, eine auf die Hilfe von B-Zellen spezialisierte Population von CD4+ T-Zellen. Obwohl Tfh-Zellen bereits im Jahre 2000 zuerst beschrieben wurden, fehlt bis heute ein robustes und reproduzierbares Protokoll für deren in vitro Differenzierung aus murinen CD4+ T-Zellen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde TGFβ als ein essentieller Faktor für die in vitro Tfh-Zell-Differenzierung identifiziert. TGFβ wurde nicht nur für die Initiierung sondern auch für die Aufrechterhaltung der Proteinexpression des für Tfh-Zellen charakteristischen Chemokinrezeptors CXCR5 benötigt. Zuerst wurde ein robustes und reproduzierbares Protokoll für die Tfh-Zell-Generierung aus naiven Maus-CD4+ T Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28 Stimulation etabliert. Diese in vitro-generierte, TGFβ-induzierte CXCR5+ Zellpopulation wies transkriptionelle und funktionale Eigenschaften von in vivo-generierten Tfh-Zellen auf. Wir zeigten, dass der TGFβ Signalweg von biologischer Relevanz für die Tfh-Differenzierung in vivo ist. Ein Knockout des TGFβ Rezeptors in CD4+ T-Zellen verhinderte die Expression von CXCR5 und resultierte in einer signifikanten Reduktion der Tfh-Zellen in einem Protein-Immunisierungs-Szenario. Eine weitere Optimierung der in vitro Tfh-Zell-Differenzierung basierte auf der Reduktion der Zelldichte in der Zellkultur, wodurch die parakrine Signalweiterleitung von IL-2 reduziert und dadurch eine Verstärkung der Tfh-Zell-Differenzierung erreicht werden konnte. Im weiteren Verlauf wurde das neuartige in vitro-Zellkulturprotokoll angewendet, um die Plastizität von Tfh- und Th17-Zellen zu untersuchen. So konnte gezeigt werden, dass in klassischen Th17-Zellkulturen sowohl Th17- als auch Tfh-Zellen induziert werden. Mittels RNA-Sequenzierung wurden potentielle Transkriptionsfaktoren identifiziert, die im weiteren Verlauf der Arbeiten funktional mittels CRISPR/Cas9 getestet wurden. c-Maf wurde dabei als ein molekularer Schalter für die Zell-Schicksalsentscheidung zwischen Tfh und Th17 identifiziert und sowohl in vitro als auch in vivo im akuten LCMV-Model validiert. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit ein robustes und reproduzierbares Protokoll für die Tfh-Zell-Differenzierung aus naiven Maus-CD4+ T-Zellen entwickelt und validiert. Dieses Protokoll schafft eine vielseitige Plattform, die es erlaubt, die Tfh-Zell-Differenzierung und Plastizität in Zukunft noch viel detaillierter untersuchen zu können. Mit Hilfe dieser Zellkultur wurde c-Maf als ein treibender Faktor für die beobachtete Divergenz zwischen Tfh- und Th17-Zellen identifiziert. Darüber hinaus widerlegten wir das bisher gängige Konzept des hemmenden Effekts von TGFβ auf die Maus-Tfh-Zell-Differenzierung. Da TGFβ auch humane Tfh-Zellen induzieren kann, deuten unsere Daten darauf hin, dass die Unterschiede zwischen Mensch und Maus in Bezug auf die Tfh-Zell-Biologie womöglich kleiner sind als vorher angenommen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Tfh, T follicular helper, Th17, CXCR5, Bcl6, TGF-beta, IL-2, c-Maf
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 10. Juli 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Baumjohann, Dirk