Discovery of new cinnamic acid amides as novel antifibrotic drugs

Gerckens, Michael Wolfgang (2023): Discovery of new cinnamic acid amides as novel antifibrotic drugs. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Fibrosis is a common hallmark of most fatal chronic diseases in the industrialized world. Among pulmonary disease, progressive fibrosis is the pivotal pathomechanism of the Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF), a devastating progressive interstitial lung disease with a median patient survival time of 3-5 years. Approved pharmacotherapies only slow down, but do not stop disease progression. Thus, new antifibrotic therapeutic strategies are urgently needed. Like most fibrotic diseases, IPF pathogenesis is characterized by the deposition of excessive amounts of fibrotic extracellular matrix of activated myofibroblasts resulting in increasing loss of lung function. A phenotypic high-content ECM deposition assay was developed measuring fibrotic ECM deposition by primary human lung fibroblasts (phLFs) derived from IPF patients upon transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) and drug treatment. To identify antifibrotic compounds, 1509 small molecule compounds were screened for inhibition of TGFβ1-induced ECM deposition. Using a deep learning model 31 hit compounds were identified. Here, for the compound Tranilast a low-potent inhibitory activity on TGFβ1-induced fibroblast-myofibroblast-transdifferentiation and ECM deposition was found. By structure-activity-relationship studies of Tranilast derivatives, a group of novel cinnamic acid amides, in particular N-(2-butoxyphenyl)-3-(phenyl)acrylamides and N-(2-benzoxyphenyl)-3-(phenyl)acrylamides (N23Ps), with high potency for the inhibition of TGFβ1-dependent αSMA induction and ECM deposition was discovered. N23Ps induced strong morphological changes in phLFs, possibly due to a regulation of cytoskeletal proteins as seen in transcriptome-wide microarray analysis. Furthermore, proteomics and transcriptomics analysis showed N23Ps to inhibit specific fibrotic signatures in TGFβ1-treated phLFs as well as in a human ex-vivo injury and early 3D fibrosis model based on human precision cut lung slice tissue cultures. RNA interference rescue experiments showed an inhibition of TGFβ1 signaling by N23Ps to be SMURF2-dependent. In conclusion, a novel group of cinnamic acid amides was discovered that inhibit TGFβ1-induced profibrotic behavior of myofibroblasts in a SMURF2-dependent way.

Abstract

Fibrotische Gewebeveränderungen stellen ein gemeinsames Merkmal der häufigsten letalen Erkrankungen in der industrialisierten Welt dar. Unter den Lungenerkrankungen ist hier allen voran die Idiopathische Lungenfibrose (IPF) durch einen fortschreitende fibrotischen Umbau des Lungenparenchyms charakterisiert. Zugelassene antifibrotische Pharmakotherapien verlangsamen das Progress der Erkrankung, können diesen jedoch nicht aufhalten. IPF-Patienten überleben im Median 3-5 Jahre nach Diagnosestellung. Hieraus ergibt sich ein dringender Bedarf an neuen antifibrotischen Wirkstoffen und Therapien. Wie in anderen fibrotischen Erkrankungen, ist die Pathogenese der IPF durch die pulmonale Deposition erhöhter Mengen von extrazellulärer Matrix (EZM), größtenteils durch aktivierte Myofibroblasten charakterisiert. Es wurde ein phänotypisches immunocytochemisches, sogenanntes high-content, Hochdurchsatz-Assay zur Messung von fibrotischer EZM-Deposition durch mit transforming growth factor β 1 (TGFβ1) und Wirkstoffen behandelten primäre humane Lungenfibroblasten (phLFs) entwickelt, welche aus Lungengewebe von IPF-Patienten isoliert wurden. 1509 niedermolekulare Wirkstoffe wurden auf eine Inhibition TGFβ1-stimulierter Extrazellulärmatrix-Deposition durch phLFs gescreent. Mithilfe einer Deeplearning-basierten Immunofluoreszenzanalyse des Assays konnten 31 antifibrotische Wirkstoffkandidaten identifiziert werden. Der Wirkstoff Tranilast wies eine niederpotente Inhibition von TGFβ1-induzierter Fibroblasten-Myofibroblasten-Transdifferenzierung sowie TGFβ1-induzierter Extrazellulärmatrix-Deposition auf. Durch die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung von Tranilast-Derivaten, konnte eine neue Gruppe hochpotenter Inhibitoren von TGFβ1-induzierter Fibroblasten-Myofibroblasten-Transdifferenzierung sowie TGFβ1-induzierter Extrazellulärmatrix-Deposition, bestehend aus den Zimtsäureamiden der N-(2-butoxyphenyl)-3-(phenyl)acrylamid- and N-(2-benzoxyphenyl)-3-(phenyl)acrylamid-Gruppe (N23Ps), entdeckt werden. Im Folgenden konnte gezeigt werden, dass N23Ps eine starke Morphologie-Änderung in den pHLFs induzieren, wahrscheinlich aufgrund einer Regulation zytoskeletaler Proteine. Anschließende Transkriptom- und Proteomanalysen zeigten, dass N23Ps spezifische fibrotische Signaturen in TGFβ1-behandelten pHLFs sowie in einem humanen ex-vivo Model für frühe lungenfibrotischen Veränderungen, basierend auf Gewebekulturen von humanen precision cut lung slices (hPCLS), inhibieren. RNA-Interferenz-Experimente zeigten, dass die Inhibition von TGFβ1-Signalwegen durch N23Ps von der Ubiquitin-Protein-Ligase SMURF2 abhängig ist. Zusammenfassend wurde eine neue Gruppe an Zimtsäureamiden entdeckt, welche TGFβ1-induzierte profibrotische Myofibroblastenaktivität SMURF2-abhängig hemmt.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: fibrosis, lung fibrosis, drug discovery, drug development, myofibroblast,
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 19. Oktober 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Eickelberg, Oliver