Glioblastoma cell-derived apelin has differential effects on myeloid cell migration

Enders, Jonathan Andreas (2023): Glioblastoma cell-derived apelin has differential effects on myeloid cell migration. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Das Glioblastom (GBM) stellt den häufigsten malignen Hirntumor dar und betrifft pro Jahr in Europa etwa sechs von 100.000 Erwachsenen. Aggressive Interventionen zur Behandlung des Tumors umfassen die Chirurgie, Chemo- und Radiotherapie. Dennoch ist die Ein-Jahres-Überlebensrate mit 20% gering. GBMs charakterisieren sich durch sehr invasives Wachstum mit ausgeprägter Vaskularisation. Die Tumormasse besteht neben Tumorzellen auch aus Immunzellen. Diese tragen zur Bildung eines lokalen Milieus bei, das von den Tumorzellen für deren Wachstum und zur Infiltration anderer Hirnregionen genutzt wird. Tumorassoziierte Mikroglia und Makrophagen (TAM) repräsentieren bis zu 50% dieser Nicht-Tumorzellen in der Mikroumgebung von GBM, weshalb sie ein mögliches Ziel für zukünftige Therapien darstellen. Im GBM Mausmodell fand unsere Arbeitsgruppe unter der Leitung von Dr. Roland Kälin Hinweise auf eine signifikant erniedrigte TAM-Dichte im Umfeld von Gliomen deren APLN-Expression ausgeschaltet worden war. Hieraus resultierte die Hypothese, der Apelin-Apelinrezeptor (APLN/APLNR)-Signalweg könnte für die Rekrutierung myeloider Zellen durch GBM von Bedeutung sein. In dieser Doktorarbeit wird der APLN/APLNR-Signalweg im Kontext der Interaktion von GBM und TAM untersucht. Ich zeige eine direkte Korrelation zwischen starker Expression von APLN in GBM und einer entsprechend erhöhten Dichte von TAM in der Mikroumgebung des Tumors auf. Zudem demonstriere ich, dass APLNR sowohl von BV2 Mikroglia als auch von J774 Makrophagen exprimiert wird. Eine immunologische Stimulation dieser Zellen mit Lipopolysaccharid (LPS) – zur Simulation einer Entzündungsantwort – resultiert in einer niedrigeren Expression des Rezeptorgens. Der APLN/APLNR-Signalweg scheint im Rahmen dieser Entzündungsantwort daher keine besondere Bedeutung zu haben. Ich zeige auch, dass isoliertes Apelin-13 Peptid zwar die Migration von Mikroglia signifikant erhöht, jedoch auf die Mobilisation von Makrophagen keine größere 1 Auswirkung hat. Für eine bessere Simulation der in vivo Situation verwende ich statt isoliertem Apelin-13 den Zellüberstand von kultivierten Gliomzellen. Ich vergleiche Medium von APLN-Wildtyp-Gliomzellen (WT) mit Medium von APLN-knockdown- Zellen (KD). Hierbei zeigen Mikroglia im Gegensatz zu Makrophagen ein überwiegend verändertes Wanderungsverhalten. Hohe APLN-Expression des Tumors führt zu einer chemo-attraktiven Wirkung auf BV2 Zellen. Daher vermute ich, dass verschiedene GBM Zellen unterschiedliche Signalwege zur Rekrutierung von Mikroglia nutzen – der APLN/APLNR-Signalweg wäre insofern vor allem für Tumore mit hoher APLN-Expression von Bedeutung. Für Makrophagen konnte ich keinen direkten Einfluss von Apelin auf deren Wanderungsverhalten zeigen. Im Kontext von GBM wirkt APLN unterschiedlich auf Mikroglia und Makrophagen. Verschiedene GBM Zellen und deren APLN Expression scheinen das Verhalten von TAM auf unterschiedliche Weise zu beeinflussen. Es werden weitere Studien nötig sein, um die genaue Bedeutung des APLN/APLNR-Signalweges für die Rekrutierung vom TAM durch GBM offenzulegen. Für einige GBM Zellen scheint er jedoch von entscheidender Relevanz zu sein, womit er auch ein potenzielles Ziel zukünftiger Therapieansätze darstellt. Werden Mikroglia und Makrophagen dem Kulturmedium verschiedener GBM Zellen ausgesetzt, so zeigt Mikroglia eine geringere Mobilität und Makrophagen eine gesteigerte. Immunhistologisch kann außerdem eine direkte Korrelation von APLN- Expression der GBM-Zellen und der Dichte an TAM im Gehirn gezeigt werden. Gemeinsam führen die Beobachtungen zu der Vermutung, dass Makrophagen im unmittelbaren Umfeld der Gliome die vorherrschenden myeloiden Zellen sind. Um dies jedoch ganz schlüssig zu beweisen, sind weitere Experimente mit einer immunhistologischen Differenzierung zwischen Mikroglia und Makrophagen notwendig.

Abstract

Glioblastoma (GBM) is the most common malignant brain tumor affecting approximately six people every 100.000 adults in Europe every year. Aggressive interventions like surgery, chemo- and radiotherapy have been established to treat the tumor, nevertheless the one-year survival rate is only 20%. GBMs are characterized as very invasive tumors with abundant vascularization. Their microenvironment was shown to include immune cells. These cells create a local milieu, which is used by neoplastic cells to grow and infiltrate other brain regions. Tumor-associated microglia and macrophages (TAM) represent up to 50% of these non-tumor cells in the microenvironment of GBM and therefore represent an interesting target for future therapies. In GBM mouse models our group – led by Dr. Roland Kälin – found a significant reduction of TAM density when APLN expression was knocked out in GBM cells. We considered apelin-apelin receptor (APLN/APLNR)-signaling might be part of GBM myeloid cell recruitment. In this study I investigated the role of APLN/APLNR-signaling in the context of GBM cell interaction with TAM. I found a direct correlation of APLN expression levels and the density of TAM in the microenvironment of GBM. Furthermore, I showed APLNR to be expressed in BV2 microglia and J774 macrophages. Immunological stimulation of these cells with lipopolysaccharide (LPS) to simulate an inflammatory reaction resulted in a lower expression of the receptor gene. I considered APLN/APLNR- signaling to have a low relevance in the context of a typical inflammatory response. I demonstrated that the apelin-13 peptide is chemoattractive for microglia but not for macrophages. To improve the simulation of the in vivo situation, I used glioma supernatant instead of recombinant apelin-13. Under these conditions I compared APLN wildtype (WT) and knockdown (KD) GBM cells. GBM-derived apelin affected migration of microglia stronger than migration of macrophages. I considered that GBM use various pathways – amongst them APLN/APLNR-signaling – to attract microglia towards the tumor. Microglia is attracted especially by strong APLN 3 expressing GBM. For macrophages I could not show a significant influence of apelin on cell migration. In the context of GBM, APLN acts in different ways on microglia and macrophages. Different GBM subtypes and their individual APLN expression levels have distinct effects on TAM. Further studies are required to fully disclose the role of APLN/APLNR-signaling in TAM recruitment of GBM. Nevertheless, APLN/APLNR- signaling seems to be a relevant pathway in this process for some glioma cells and therefore represents a potential therapeutic target in the future. When microglia and macrophages are exposed to different GBM-conditioned medium, microglia show reduced mobility and macrophages increased mobility. In addition, a direct correlation between APLN expression of GBM cells and the density of TAM in the brain can be shown immunohistologically. Together, the observations suggest that macrophages are the predominant myeloid cells in the immediate vicinity of gliomas. However, to prove this, further experiments with an immunohistological differentiation between microglia and macrophages are necessary.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: glioblastoma, myeloid cells, microglia, macrophages, apelin
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 19. Oktober 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Glaß, Rainer