Role of TGF-β/SMAD4/c-MYC-regulated NLE1 in tumor growth and liver metastasis of colorectal cancer

Loevenich, Leon (2023): Role of TGF-β/SMAD4/c-MYC-regulated NLE1 in tumor growth and liver metastasis of colorectal cancer. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

TGF-β signaling plays an essential role in colorectal cancer (CRC) progression. Patients frequently suffer from mutations in the TGFBR2 gene or deletions of SMAD4. These mutations correlate with a poorer survival rate in CRC patients. How these genetic changes contribute to tumor growth and metastatic spread is not fully understood. Thus, an in-depth analysis of the gene expression profiles of CRC patients acquiring a SMAD4 deletion could help to identify new therapeutic options. Here, we used the CRISPR/Cas9 approach to introduce a deletion of SMAD4 in patient-derived tumor organoids (PDTOs) and investigate their effect on the gene expression profile when exposed to a TGF-β-rich environment. Thereby, we could observe that SMAD4-deficient PDTOs acquire an enrichment in the expression of c-MYC target genes and human colonic stem cell gene sets. Only 11 of the 284 deregulated genes (FBL, GINS2, IFITM3, LSM6, MYC, NAT10, NLE1, POLR3K, PRMT1, PSMG4, RRP1) confer an advantage for tumor cell fitness according to DepMap. Four of these genes (FBL, NAT10, NLE1, RRP1) are part of ribosome biogenesis. They might contribute to the increased protein biosynthesis levels observed in advanced CRC. Since the role of NLE1 in the progression of CRC is not fully understood, we decided to focus our studies on the regulation and function of NLE1 in CRC. We found that NLE1 expression was upregulated upon SMAD4 loss in TGF-β-exposed PDTOs and that c-MYC can bind to the promoter of NLE1. Thereby, c-MYC prevents TGF-β-mediated downregulation of NLE1. Furthermore, NLE1 levels were higher in different CRC cohorts than in normal tissues and significantly enriched in Wnt/MYC CRC molecular subtypes. After the deletion of NLE1 in different CRC cell lines and PDTOs, we could observe an apparent reduction in de novo protein biosynthesis rates. In accordance, the deletion of NLE1 also resulted in slower proliferation kinetics, reduced colony formation, and less anchorage-independent growth in CRC cell lines. Moreover, NLE1 knockout cells showed higher levels of apoptosis, a reduced migratory/invasive capacity, and underwent cell cycle arrest and apoptosis. In the case of PDTOs, smaller organoid sizes and reduced clonogenicity during the loss of NLE1 were observed. This phenotype was also reflected in an endoscopy-guided orthotopic mouse transplantation model. Primary tumors lacking NLE1 expression were smaller than NLE1 wild-type derived tumors, and the affected animals showed less metastatic burden in the liver. As a downstream effect, NLE1-deficient cells showed activation of p38/MAPK, accumulation of p62- and LC3-positive structures, which defines impaired autophagy, and higher ROS levels. Furthermore, deletion of NLE1 in TP53 proficient cancer and normal human colonic epithelial cells led to cell cycle arrest rather than apoptosis, and NLE1 mRNA levels predicted relapse-free survival in CRC patients. In summary, we could show that a TGF-β/SMAD4/c-MYC axis regulates NLE1 and represents a limiting factor for de novo protein biosynthesis and the tumorigenic potential of advanced CRC. To which extent therapeutic targeting of NLE1 can be used as a treatment of CRC in a clinical setting warrants further investigation. TGF-β signaling plays an essential role in colorectal cancer (CRC) progression. Patients frequently suffer from mutations in the TGFBR2 gene or deletions of SMAD4. These mutations correlate with a poorer survival rate in CRC patients. How these genetic changes contribute to tumor growth and metastatic spread is not fully understood. Thus, an in-depth analysis of the gene expression profiles of CRC patients acquiring a SMAD4 deletion could help to identify new therapeutic options. Here, we used the CRISPR/Cas9 approach to introduce a deletion of SMAD4 in patient-derived tumor organoids (PDTOs) and investigate their effect on the gene expression profile when exposed to a TGF-β-rich environment. Thereby, we could observe that SMAD4-deficient PDTOs acquire an enrichment in the expression of c-MYC target genes and human colonic stem cell gene sets. Only 11 of the 284 deregulated genes (FBL, GINS2, IFITM3, LSM6, MYC, NAT10, NLE1, POLR3K, PRMT1, PSMG4, RRP1) confer an advantage for tumor cell fitness according to DepMap. Four of these genes (FBL, NAT10, NLE1, RRP1) are part of ribosome biogenesis. They might contribute to the increased protein biosynthesis levels observed in advanced CRC. Since the role of NLE1 in the progression of CRC is not fully understood, we decided to focus our studies on the regulation and function of NLE1 in CRC. We found that NLE1 expression was upregulated upon SMAD4 loss in TGF-β-exposed PDTOs and that c-MYC can bind to the promoter of NLE1. Thereby, c-MYC prevents TGF-β-mediated downregulation of NLE1. Furthermore, NLE1 levels were higher in different CRC cohorts than in normal tissues and significantly enriched in Wnt/MYC CRC molecular subtypes. After the deletion of NLE1 in different CRC cell lines and PDTOs, we could observe an apparent reduction in de novo protein biosynthesis rates. In accordance, the deletion of NLE1 also resulted in slower proliferation kinetics, reduced colony formation, and less anchorage-independent growth in CRC cell lines. Moreover, NLE1 knockout cells showed higher levels of apoptosis, a reduced migratory/invasive capacity, and underwent cell cycle arrest and apoptosis. In the case of PDTOs, smaller organoid sizes and reduced clonogenicity during the loss of NLE1 were observed. This phenotype was also reflected in an endoscopy-guided orthotopic mouse transplantation model. Primary tumors lacking NLE1 expression were smaller than NLE1 wild-type derived tumors, and the affected animals showed less metastatic burden in the liver. As a downstream effect, NLE1-deficient cells showed activation of p38/MAPK, accumulation of p62- and LC3-positive structures, which defines impaired autophagy, and higher ROS levels. Furthermore, deletion of NLE1 in TP53 proficient cancer and normal human colonic epithelial cells led to cell cycle arrest rather than apoptosis, and NLE1 mRNA levels predicted relapse-free survival in CRC patients. In summary, we could show that a TGF-β/SMAD4/c-MYC axis regulates NLE1 and represents a limiting factor for de novo protein biosynthesis and the tumorigenic potential of advanced CRC. To which extent therapeutic targeting of NLE1 can be used as a treatment of CRC in a clinical setting warrants further investigation.

Abstract

Der TGF-β Signalweg spielt eine zentrale Rolle bei der Entstehung von Darmkrebs. Häufig zeigen Patienten Mutationen im TGFBR2 Gen oder Deletionen von SMAD4. Diese Mutationen korrelieren mit einer schlechten Überlebensrate von Darmkrebspatienten. Wie diese genetischen Veränderungen zum Tumorwachstum und zur Ausbreitung von Metastasen beitragen, ist bisher nicht vollständig verstanden. Daher könnte eine umfassende Analyse der Genexpressionsprofile von Darmkrebspatienten, die eine SMAD4-Deletion erwerben, helfen, neue therapeutische Ansätze zu identifizieren. Zunächst wurde mittels CRISPR/Cas9 eine Deletion von SMAD4 in Patienten-abgeleiteten Tumororganoiden (PDTOs) eingeführt, um dann ihre Wirkung auf das Genexpressionsprofil zu untersuchen, wenn sie einer TGF-β reichen Umgebung ausgesetzt sind. Dabei konnten wir beobachten, dass SMAD4-defiziente PDTOs eine Anreicherung für c-MYC-Zielgene und humane Kolonstammzellgene erwerben. Interessanterweise zeigten nur 11 der 284 deregulierten Gene (FBL, GINS2, IFITM3, LSM6, MYC, NAT10, NLE1, POLR3K, PRMT1, PSMG4, RRP1) einen Vorteil für die Fitness von Tumorzellen. 4 dieser Gene (FBL, NAT10, NLE1, RRP1) sind Teil der Ribosomenbiogenese und könnten zu einer erhöhten Proteinbiosynthese beitragen, die bei fortgeschrittenem Darmkrebs beobachtet wird. Da die Rolle von NLE1 beim Fortschreiten von Darmkrebs noch nicht vollständig geklärt ist, hatten wir uns entschlossen, unseren Fokus daraufzulegen. Dabei fanden wir heraus, dass die Expression von NLE1 nach SMAD4 Verlust in TGF-β-exponierten PDTOs hochreguliert wurde und dass c-MYC in der Lage ist, an den Promotor von NLE1 zu binden. Dadurch verhindert c-MYC das TGF-β-vermittelte Herunterregeln von NLE1. Darüber hinaus war die Expression von NLE1 in verschiedenen Kohorten von Darmkrebspatienten höher im Vergleich zu Normalgewebe und insbesondere in Wnt/MYC Subgruppen von Darmkrebspatienten angereichert. Nach Deletion von NLE1 in verschiedenen kolorektalen Krebszelllinien und PDTOs konnten wir eine deutliche Reduktion der de-novo-Proteinbiosyntheseraten beobachten. Dementsprechend führte die Deletion von NLE1 auch zu einer langsameren Proliferationskinetik, weniger Koloniebildung und weniger verankerungsunabhängigem Wachstum in kolorektalen Krebszelllinien. Darüber hinaus zeigten NLE1-defiziente Zellen verstärkt Apoptose, eine geringere Migrations-/Invasionskapazität und einen Stillstand des Zellzyklus. Bei den PDTOs wurde eine kleinere Organoidgröße und eine verringerte Klonogenität nach Verlusts von NLE1 beobachtet. Dieser Phänotyp spiegelte sich auch in einem Endoskopie-gestützten orthotopen Maustransplantationsmodell wieder. Primärtumore von NLE1-defizienten Zellen waren im Vergleich zu Tumoren, die vom NLE1 Wildtyp Zellen stammten, kleiner und zeigten auch eine geringere Fähigkeit zur Ausbildung von Metastasen in der Leber. Des Weiteren zeigten NLE1-defiziente Zellen eine Aktivierung von p38/MAPK, eine Akkumulation von p62- und LC3-positiven Strukturen, was eine beeinträchtigte Autophagie definiert, und vermehrt oxidativen Stress. Darüber hinaus führte die Deletion von NLE1 in TP53 Wildtyp Krebs- und normalen menschlichen Dickdarmepithelzellen eher zu einem Zellzyklusstillstand als zu Apoptose, und die NLE1 mRNA Expression prognostizierte ein Rezidiv-freies Überleben bei Darmkrebspatienten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass NLE1 durch eine TGF-β/SMAD4/c-MYC-Achse reguliert wird und ein limitierender Faktor für die de-novo-Proteinbiosynthese und das tumorogene Potenzial von fortgeschrittenem Darmkrebs darstellt. Inwieweit eine Blockierung von NLE1 als therapeutischer Ansatzpunkt im Darmkrebs dienen kann, müssen weitere Studien erst noch zeigen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 26. September 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Hermeking, Heiko