The contribution of gamma-herpes viruses on the development of CD30+ B cell lymphomas: research and investigation in a mouse model

Chew, Zakir Hassan (2023): The contribution of gamma-herpes viruses on the development of CD30+ B cell lymphomas: research and investigation in a mouse model. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

EBV and KSHV are two gammaherpesviruses that are known to be highly associated with CD30-positive lymphomas, such as Hodgkin lymphomas. Whether deregulated CD30-signaling cooperates with herpes viral infections in tumorigenesis is not well understood. Thus, the aim of the thesis was to establish a system allowing for the investigation of the interplay between a dysregulated CD30 expression and EBV infection in lymphomagenesis in a mouse model. EBV does not infect murine B cells, thus, we used the murine gammaherpesvirus 68 (MHV68) as a tool to propagate infection in mice. To make MHV68 much more similar to EBV, the EBV protein LMP2a was inserted into the MHV68. To this end, LMP2a was cloned into MHV68 to obtain MHV68-LMP2a, enabling the analysis of the effects of LMP2a in vivo after infection of mice. Thus, the potential contribution of the EBV protein LMP2a to lymphomagenesis could be investigated in mice. To induce the dysregulated constitutive CD30 expression in B cells upon MHV68 infection, LMP1/CD30γ1cre (LC30) mice were used. These mice contain a LMP1/CD30 fusion protein in the R26 locus together with a loxP flanked stop cassette. B cells responding to the MHV68 infection express Cre, resulting in deletion of the stop-cassette followed by expression of the LMP1/CD30 fusion protein (LC30) together with the reporter hCD2. After generating a MHV68-LMP2a, the recombinant virus was first tested for fitness in wild-type C57BL/6 mice, in comparison to wild-type MHV68. MHV68-LMP2a was similar to wild-type MHV68 regarding lytic replication in the lung but established less latency in the spleen when compared to wild-type MHV68. Next, MHV68-LMP2a was used to infect LMP1/CD30γ1cre (LC30) mice. As control virus, MHV68-NGF-R was used, which expresses a truncated Nerve-growth factor receptor (NGF-R) instead of LMP2a. As control mice, we infected R26 CARγ1cre mice, which express the reporter gene CAR instead of LC30/hCD2. Virus infection in LC30 mice led to a higher percentage of reporter positive B cells when compared to control CAR mice. Moreover, two months after infection, the splenomegaly was increased in LC30 in comparison to control mice, suggesting an expansion of LC30 expressing B cells. From acute infections at 14 days to chronic infections of 2 months, constitutive CD30 expression forced germinal center B cells to leave the germinal center, evident from the reduced percentage of reporter positive GCB cells at 2 months post infection in CD30 mice compared to controls. Instead, more reporter positive B cells with a B1 cell phenotype and plasma cells were detected in LC30 compared to control CAR mice. The expanded reporter positive B1 cell population was detected in the spleen and in the peritoneal cavity. Currently, it is still unclear whether these reporter positive cells are derived from GC B cells. The LMP2a protein, on the other hand, did not significantly affect the phenotype and expansion of LMP1/CD30 expressing B cells. The only difference which we could detect between MHV68-LMP2a and MHV68-NGF-R was a slightly enhanced GC formation after infection of CAR mice. Enhanced germinal center B cell formation and proliferation by LMP2a expression could play a role in formation of lymphomas. In summary, most of the differences observed in the experiments were due to the constitutive signaling of the CD30 in LMP1/CD30γ1cre when infected with the two viruses, and not to the expression of LMP2a. A potential reason for the latter might be that LMP2A is switched off during latency. Though further studies need to be conducted, the data shown here suggest that dysregulated CD30 expression, combined with gammaherpesvirus infection, might be associated with accelerated tumorigenesis. To answer the question whether infection with MHV68-LMP2a, when compared to infection with MHV68-NGFR, leads to further enhancement of lymphoma development in LMP1/CD30γ1cre mice, more investigations and studies need to be done in the future.

Abstract

EBV und KSHV sind zwei Gammaherpesviren, von denen bekannt ist, dass sie stark mit CD30-positiven Lymphomen wie Hodgkin-Lymphomen assoziiert sind. Ob eine fehlregulierte CD30- Signaltransduktion mit herpesviralen Infektionen bei der Tumorentstehung zusammenwirkt, ist noch nicht vollständig verstanden. Ziel dieser Arbeit war es daher, ein System zu etablieren, mit dem das Zusammenspiel zwischen einer fehlregulierten CD30-Expression und einer EBV-Infektion bei der Lymphomagenese im Mausmodell untersucht werden kann. EBV infiziert keine Maus-B-Zellen, daher wurde das Murine Gammaherpesvirus 68 (MHV68) als Modell verwendet. Um die Rolle des EBV-Proteins LMP2a in vivo zu untersuchen, wurde LMP2a in MHV68 eingefügt. Zu diesem Zweck wurde LMP2a in MHV68 kloniert, um MHV68-LMP2a zu erhalten. Somit konnte der potenzielle Beitrag des EBV-Proteins LMP2a zur Lymphomagenese bei Mäusen untersucht werden. Um die fehlregulierte konstitutive CD30-Expression in B-Zellen nach einer MHV68-Infektion zu induzieren, wurden LMP1/CD30γ1cre (LC30) Mäuse verwendet. Diese Mäuse enthalten ein LMP1/CD30-Fusionsprotein im R26-Lokus zusammen mit einer loxP-flankierten Stoppkassette. B-Zellen, die auf die MHV68-Infektion reagieren, exprimieren Cre, was zur Deletion der Stoppkassette und damit zur Expression des LMP1/CD30-Fusionsproteins (LC30) sowie des Reporters hCD2 führt. Nach der Generierung eines MHV68-LMP2a wurde das rekombinante Virus zunächst in Wildtyp-C57BL/6-Mäusen auf seine Fitness im Vergleich zu Wildtyp-MHV68 getestet. MHV68-LMP2a ähnelte dem Wildtyp-MHV68 in Bezug auf die lytische Replikation in der Lunge, führte jedoch im Vergleich zum Wildtyp-MHV68 zu einer geringeren Latenz in der Milz. Als nächstes wurde MHV68-LMP2a verwendet, um LMP1/CD30γ1cre (LC30) Mäuse zu infizieren. Als Kontrollvirus wurde MHV68-NGFR verwendet, das anstelle von LMP2a einen verkürzten Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor (NGFR) exprimiert. Als Kontrollmäuse infizierten wir R26-CARγ1cre Mäuse, die anstelle von LC30/hCD2 das Reportergen CAR exprimieren. Die Virusinfektion bei LC30-Mäusen führte im Vergleich zu CAR-Kontrollmäusen zu einem höheren Prozentsatz an Reporter-positiven B-Zellen. Darüber hinaus war die Splenomegalie zwei Monate nach der Infektion bei LC30 im Vergleich zu Kontrollmäusen erhöht, was auf eine Expansion von LC30- exprimierenden B-Zellen schließen lässt. Innerhalb des Zeitraums von 14 Tagen (akute Phase) bis zu zwei Monaten (chronische Phase) nach Infektion führte die konstitutive CD30-Expression dazu, dass die Keimzentrums- B-Zellen das Keimzentrum verlassen, was aus dem reduzierten Prozentsatz an Reporter-positiven Keimzentrums-B-Zellen zwei Monate nach der Infektion bei CD30-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen ersichtlich ist. Stattdessen wurden in LC30 im Vergleich zu Kontroll-CAR-Mäusen mehr Reporter-positive B-Zellen mit einem B1-Zellphänotyp und Plasmazellen nachgewiesen. Die expandierte Reporter-positive B1-Zellpopulation wurde in der Milz und in der Peritonealhöhle nachgewiesen. Derzeit ist noch unklar, ob diese Reporter-positiven Zellen von Keimzentrums-B-Zellen abgeleitet sind. Andererseits beeinflusste das LMP2a Protein den Phänotyp und die Expansion von LMP1/CD30-exprimierenden B Zellen nicht signifikant. Der einzige Unterschied, den wir zwischen MHV68-LMP2a und MHV68-NGFR feststellen konnten, war eine leicht erhöhte Keimzentrums-Bildung nach Infektion von CAR-Mäusen. Eine verstärkte Keimzentrums-B Zellbildung und -Proliferation durch die LMP2a-Expression könnte eine Rolle bei der Entstehung von Lymphomen spielen. Zusammenfassend waren die meisten in den Experimenten beobachteten Unterschiede auf die konstitutive Signaltransduktion des CD30 in LMP1/CD30γ1cre Mäusen bei Infektion mit den beiden Viren zurückzuführen und nicht auf die Expression von LMP2a. Ein möglicher Grund für Letzteres könnte sein, dass LMP2A während der Latenzzeit ausgeschaltet wird. Obwohl weitere Studien durchgeführt werden müssen, legen die hier gezeigten Daten nahe, dass eine fehlregulierte CD30-Expression in Kombination mit einer Gammaherpesvirus-Infektion mit einer beschleunigten Tumorentstehung assoziiert sein könnte. Ob eine Infektion mit MHV68-LMP2a im Vergleich zur Infektion mit MHV68-NGFR zu einer weiteren beschleunigten Entwicklung der Lymphome bei LMP1/CD30γ1cre Mäusen führt, muss in Zukunft in weiteren Studien untersucht werden.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: CD30+, MHV68, LMP2a, Gammaherpesvirus, lymphoma
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 30. März 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Zimber-Strobl, Ursula