Different roles of Regnase3 in resident macrophages and tubular epithelial cells in kidney disease

Li, Chenyu (2023): Different roles of Regnase3 in resident macrophages and tubular epithelial cells in kidney disease. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Akutes Nierenversagen (ANV) ist eine häufige, jedoch schwere Erkrankung, die v.a. in klinischen Einrichtungen auftritt. ANV ist durch einen plötzlichen Rückgang der Nierenfunktion gekennzeichnet und wird durch den Anstieg des Serum-Kreatinin-Spiegels und die Abnahme der Urinausscheidung oder beides angezeigt. Die Prognose von ANV ist selbst für Überlebende schlecht, da viele Patienten nach einem schweren ANV eine chronische Niereninsuffizienz entwickeln können, was den Einsatz von Nierenersatzverfahren nowendig macht. Dies beeinträchtigt nicht nur die Lebensqualität der Patienten, sondern erhöht auch die Belastung für pflegende Angehörige und medizinische Kosten. Derzeit gibt es keine pharmazeutisch wirksamen präventiven oder therapeutischen Maßnahmen für ANV, es stehen lediglich Dialyse und unterstützende medizinische Versorgung zur Verfügung. Ribonukleinsäure (Ribonucleic acid, RNA)-bindende Proteine (RBPs) sind eine Klasse von Proteinen, die eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Genexpression spielen und bei einer Vielzahl von Erkrankungen beteiligt sind. Diese Proteine besitzen die Fähigkeit, unterschiedliche Transkripte zu binden und dadurch komplexe regulative Netzwerke zu bilden, die für die Erhaltung der Zellintegrität von entscheidender Bedeutung sind. Neuere Studien haben gezeigt, dass eine Reihe von RBPs an ANV beteiligt sind, darunter das kälteinduzierbare RNA-bindende Protein, humanes Antigen R, Pumilio und Y-Box-bindendes Protein. Regnase 3 ist ein Mitglied der Regnase RBP Familie und fördert Entzündungen, indem es die Expression vonTumor Nekrose Faktor (TNF) in Makrophagen erhöht und Interleukin 6 (IL6) in plasmazytoiden dendritischen Zellen unterdrückt. Trotz dieses Wissens ist die Bedeutung der Rolle, die Regnase 3 in renalen Tubuluszellen spielt, unbekannt. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass Regnase 3 sowohl in Makrophagen als auch in renalen Tubuluszellen eine Rolle spielt und Entzündungen und Tubulusreparatur in ANV beeinflusst. Um die mögliche Rolle von Regnase 3 bei Nierenschädigungen zu untersuchen, wurden eine Reihe von genetisch veränderten Mäusen im Hintergrund C57BL/6J hergestellt. Diese Mauslinien umfassten paired box gene 8 (Pax8)-reverse tetracycline transactivator (rTtA, Pax8rTtA), tetracycline resistance protein (TetO)-Cre (TetOCre), transgenic receptor activator of nuclear factor kappa-Β (Rank)-Cre (RankCre), and Regnase 3 floxed (Regnase3fl/fl) Mäuse. Diese genetisch veränderten Mäuse haben wir in einer Reihe von experimentellen Tiermodellen eingesetzt, um die Auswirkungen von Regnase 3 auf Nierenschädigung zu untersuchen, darunter ein unilaterales Nierenischämie-Reperfusionsmodel mit oder ohne Nephrektomie und ein Nephrocalcinose-induziertes Nierenschädigungsmodel. Zusätzlich haben wir in vitro-Modelle mit primären Nieren- und Entzündungszellen verwendet, um die Auswirkungen von Regnase 3 auf der Zellenebene zu studieren. Darüber hinaus haben wir single cell und bulk RNA-Sequenzierung durchgeführt, um die zugrundeliegenden Mechanismen der Funktion von Regnase 3 zu untersuchen. Wir entdeckten, dass Regnase 3 in renalen Makrophagen nach ANV hoch exprimiert ist. Wir beobachteten, dass die Regnase 3-Expression positiv mit Phagozytose, Chemokinenproduktion und Monozytenreifung korrelieren. Darüber hinaus litten Rank-Regnase 3 Mäuse nach ANV aufgrund der Zunahme der CCR2-positiven Zellinfiltration im Vergleich zur Wildtyp-Kontrollgruppe mehr an Entzündung und Nierenschädigung. In vitro-Experimente zeigten, dass Regnase 3 an der Modulation der Makrophagenfunktion beteiligt ist, indem es die Polarisation von Makrophagen zu einem M1- und M2-Phänotyp bewirkt und die Zellmigration beeinflusst. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Regnase 3 bei der Makrophagenmigration und -infiltration nach ANV eine entscheidende Rolle spielt, die sowohol zur frühen Entzündungsphase nach ANV als auch der Progression zur chronischem Nierenversagen beiträgt. Im nächsten Schritt wollten wir die Rolle von Regnase 3 im Kontext von Nierentubulusschädigung untersuchen. Wir beobachteten, dass Regnase 3 in gesunden Nierentubuli hoch exprimiert ist, aber die Expression nach Verletzung deutlich reduziert ist. Mittels in vivo- und in vitro-Experimenten fanden wir heraus, dass Regnase 3 eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der frühen Apoptose, Zelltod, Proliferation und Wundheilung von tubulären Epithelzellen spielt. Diese Auswirkungen tragen zur Nierenverletzung bei postischemischen Nieren bei. Darüber hinaus entdeckten wir, dass Regnase 3-Defizienz Schutz vor ischämischem ANV bietet. Unsere Daten belegen, dass Regnase 3 prä-RNA erkennt und alternatives Splicing durch die Erhöhung des Anteils an gezielt übersprungenen Exonen und die Verringerung der Wahrscheinlichkeit gezielter behaltener Introne moduliert. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Regnase 3 eine wichtige Rolle bei ANV spielt und möglicherweise ein potenzielles Ziel für therapeutische Interventionen sein könnte. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass Regnase3 eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Nierenschäden in postischemischen Nieren spielt und somit ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Behandlung von renalen IRI darstellt. Der Einfluss von Regnase3 auf Nierenschäden ist jedoch von der spezifischen Zelllinie abhängig. Unsere Forschung zeigt, dass das Löschen von Rank-Regnase3 zu einer Verschlimmerung von Nierenschäden durch eine Erhöhung der Makrophagenrekrutierung führt, während das Löschen von Pax8-Regnase3 zu einer Verbesserung von Nierenschäden durch seine Auswirkungen auf Zelltod und Wundheilungsfähigkeit von tubulären Epithelzellen führt und somit einen Schutz gegen ischämische ANV bietet. Daher ist die Rolle von Regnase3 in Nierenschäden stark von Standort und Zelllinie abhängig, was letztendlich den schädlichen oder nutzbringenden Einfluss auf Nierenschäden bestimmt.

Abstract

Acute kidney injury (AKI) is a prevalent yet severe condition that occurs in clinical settings. It is characterized by a sudden decline in kidney function, as indicated by an increase in serum creatinine (Scr) levels and a decrease in urine output, or both. The prognosis for AKI is poor, with many patients progressing to acute kidney disease, chronic kidney disease (CKD), and even end-stage kidney disease especially in those who were admitted to the intensive care unit. This not only negatively impacts patients' quality of life but also increases the burden on family caregivers and medical costs. Despite this, there are currently no effective preventive or therapeutic measures for AKI, with only dialysis and supportive medical care being available. Ribonucleic acid (RNA)-binding proteins (RBPs) are a class of proteins that play a vital role in regulating gene expression and have been implicated in a wide range of diseases. These proteins possess the ability to bind and target multiple transcripts, forming intricate regulatory networks that are crucial for maintaining cellular integrity. Recent studies have revealed that a number of RBPs are involved in AKI, including the cold inducible RNA binding protein, human antigen R, Pumilio, and Y-box binding protein. Regnase3 is a member of the Regnase RBPs family and has been shown to promote inflammation by simultaneously increasing TNF in macrophages and repressing IL6 in plasmacytoid dendritic cells. Despite this knowledge, the full extent of the role played by Regnase3 in AKI remains largely unknown. Therefore, we hypothesized that Regnase3 plays a role in both macrophages and tubular epithelial cells, influencing inflammation and tubular repair in AKI. In order to investigate the potential role of Regnase3 in kidney injury, a series of genetically-modified mice were developed on the C57BL/6J genetic background. These mice included the paired box gene 8 (Pax8)-reverse tetracycline transactivator (rTtA, Pax8rTtA), tetracycline resistance protein (TetO)-Cre (TetOCre), transgenic receptor activator of nuclear factor kappa-Β (Rank)-Cre (RankCre), and Regnase3 floxed (Regnase3fl/fl) mice. Using these genetically modified mice, we applied a range of experimental animal models to study the effects of Regnase3 on kidney injury, including unilateral kidney ischemia-reperfusion surgery with or without nephrectomy and nephrocalcinosis-related kidney injury. Additionally, we employed in vitro models utilizing primary cells to study Regnase3 on the cellular level. Furthermore, we utilized scRNA-seq and RNA-seq to investigate the underlying mechanisms of Regnase3's function. We conducted a thorough investigation and discovered that the Regnase3 is highly expressed in macrophages located within the kidney after AKI. We observed that the expression levels of Regnase3 positively correlated with the functions of phagocytosis, chemokines, and monocyte maturation. Furthermore, Rank-Regnase3 mice suffered from more inflammation and kidney injury after AKI, characterized by an increase in CCR2 positive leukocyte infiltration when compared to the wildtype control group. Additionally, in vitro experiments revealed that Regnase3 is involved in modulating macrophage behavior, acting as a regulator of macrophage polarization towards an M1 and M2 phenotype and influencing the capacity of cell migration. These findings indicate that Regnase3 is essential in the migration of macrophages after AKI, which contribute to both early phase inflammation and progression towards AKI-CKD. Next, we aimed to examine the role of Regnase3 in the context of kidney and renal tubule injury. We observed that Regnase3 is highly expressed in healthy renal tubules, but its expression is significantly reduced following injury. Through in vivo and in vitro experiments, we found that Regnase3 controls early apoptosis, cell death, proliferation, and wound healing capability of tubular epithelial cells. These effects contribute to kidney injury in postischemic kidneys. Additionally, we discovered that the deletion of Regnase3 provides protection against ischemic AKI. Mechanistically, Regnase3 targets pre-RNA and modulates alternative splicing by increasing the proportion of targeted skipped exon events and decreasing the probability of targeted retained intron events. Overall, our findings indicate that Regnase3 plays a vital role in tubular epithelial cells in the response to kidney injury by regulating alternative splicing. In summary, our findings indicate that Regnase3 contributes to kidney injury in postischemic kidneys. However, the impact of Regnase3 on kidney injury is contingent upon the specific cell lineage in question. Our research demonstrates that the deletion of Rank-Regnase3 leads to an exacerbation of kidney injury by increasing macrophage recruitment, whereas the deletion of Pax8-Regnase3 leads to an improvement in kidney injury through its effects on cell death and wound healing capability of tubular epithelial cells, providing protection against ischemic AKI. Therefore, the role of Regnase3 in kidney injury is highly dependent on the cell lineage, which ultimately determines the detrimental or beneficial impact on kidney injury.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Zc3h12c, RNA binding protein, Macrophage, Acute kidney injury
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 27. Juli 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Anders, Hans-Joachim