Diabetes in a dish: Modeling and phenotyping acute and chronic type 2 diabetes mellitus in vitro in rodent heart and skeletal muscle cells

Kopp, Elena (2023): Diabetes in a dish: Modeling and phenotyping acute and chronic type 2 diabetes mellitus in vitro in rodent heart and skeletal muscle cells. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Background: Diabetes mellitus is a metabolic disorder, characterized by elevated levels of blood glucose. Type 2 diabetes (T2D) accounts for >90% of cases and is a progressive disease with initially elevated insulin levels and insulin resistance (IR). This study aims to develop a novel method for simulating T2D in vitro, including its main aspects: Hyperglycemia, hyperlipidemia and variably elevated insulin levels. Skeletal and heart muscle cells are strongly affected by IR and chronic hyperglycemia. Methods: We investigated IR, cellular respiration and mitochondrial function under different T2D-mimicking conditions in rodent skeletal (C2C12) and cardiac (H9C2) myotubes. Physiological control conditions included 5mM glucose (LG) with 20mM mannitol as osmotic controls (HM). To mimic hyperglycemia (HG), cells were exposed to 25mM glucose. Further treatment groups included the combination with insulin (I) (1nM, HGI), or palmitate (P) (75 or 150mM, HGP), or both (HGPI). After short-term (24h) or long-term (96h) exposure, we performed radioactive glucose-uptake assays and mitochondrial function assays using the Agilent Seahorse system. Ultrastructural analysis was performed using transmission electron microscopy. Results: C2C12 and H9C2 cells treated short- or long-term with insulin and/or palmitate and HG became insulin resistant. In mitochondrial respiration assays C2C12 myotubes exposed to T2D-mimicking conditions showed similar maximal respiration rates compared to physiological controls, but significantly lower ATP linked respiration and spare respiratory capacity, implying more uncoupled respiration and mitochondrial dysfunction in skeletal muscle. In contrast, H9C2 myotubes showed elevated ATP linked respiration and maximal respiration upon exposure to T2D mimicking conditions, indicating better adaptation to stress and preferential lipid oxidation in cardiac muscle in a T2D environment. Both cell lines displayed elevated fractions of swollen mitochondria after T2D mimicking treatments. Conclusions: Our stable, simple, and reproducible in vitro model of T2D causes IR, changes in ATP linked respiration, shifts in energetic phenotypes and mitochondrial morphology changes. These changes are consistent with what occurs in muscles of patients suffering from T2D. Our results support the relevance of T2D cell models that will be useful for experimental studies of pathomechanisms and screening for potential targets and therapeutic compounds also in other cell types affected by T2D.

Abstract

Hintergrund: Diabetes mellitus ist eine Stoffwechselerkrankung, gekennzeichnet durch erhöhte Blutzuckerspiegel. Typ-2-Diabetes (T2D) macht 90% der Fälle aus und ist durch anfangs erhöhte Insulinspiegel und eine progressive Insulinresistenz (IR) charakterisiert. Ziel dieser Studie ist die Entwicklung einer neuartigen Methode zur Simulation von T2D in vitro, einschließlich der wichtigsten Aspekte: Hyperglykämie, Hyperlipidämie und variabel erhöhte Insulinspiegel. Skelett- und Herzmuskelzellen sind von IR und chronischer Hyperglykämie betroffen. Methoden: Wir haben IR, Zellatmung und Mitochondrienfunktion in verschiedenen T2D-simulierenden Bedingungen in Skelett- (C2C12) und Herzmuskelzellen/Myotuben (H9C2) untersucht. Die physiologischen Kontrollbedingungen umfassten 5mM Glukose (LG) und 20mM Mannitol als osmotische Kontrolle (HM). Um eine Hyperglykämie (HG) zu simulieren, wurden die Zellen mit 25mM Glukose behandelt. Weitere Inkubationen umfassten die Kombination mit Insulin (I) (1nM, HGI) oder Palmitat (P) (75 oder 150mM, HGP) oder beidem (HGPI). Nach kurz- (24h) oder langfristiger (96h) Inkubation führten wir radioaktive Glukose-Aufnahme-Assays und mitochondriale Funktionstests mit dem Agilent Seahorse System durch. Ultrastrukturelle Analysen wurde mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie durchgeführt. Ergebnisse: C2C12- und H9C2-Zellen, die kurz- oder langfristig mit Insulin und/oder Palmitat und HG behandelt wurden, wurden insulinresistent. In Tests zur mitochondrialen Atmung zeigten C2C12 Zellen, die T2D-simulierenden Bedingungen ausgesetzt waren, im Vergleich zu LG Kontrollen ähnliche maximale Atmungsraten, aber eine signifikant niedrigere ATP-Produktion und Reserve-Atmungskapazität, was auf vermehrt entkoppelte Atmung und mitochondriale Dysfunktion im Skelettmuskel hindeutet. H9C2 hingegen zeigten eine erhöhte ATP-Produktion und maximale Atmung, nachdem sie T2D-ähnlichen Bedingungen ausgesetzt waren, was auf eine bessere Stressanpassung und verstärkte Lipidoxidation des Herzmuskels in einer T2D-Umgebung hinweist. Beide Zelllinien zeigten erhöhte Fraktionen geschwollener Mitochondrien nach T2D-simulierenden Behandlungen. Schlussfolgerungen: Unser stabiles, simples und reproduzierbares in vitro Modell von T2D bewirkt Insulinresistenz, Veränderungen in der ATP-Produktion, Verschiebungen in energetischen Phänotypen und eine veränderte Mitochondrienmorphologie. Diese Veränderungen stimmen mit dem überein, was in den Muskeln von Patienten mit T2D auftritt. Unsere Ergebnisse untermauern die Relevanz von T2D-Zellmodellen, die für experimentelle Studien von Pathomechanismen und das Screening nach potenziellen Targets und therapeutischen Wirkstoffen nützlich sein werden, auch in anderen von T2D betroffenen Zelltypen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 13. Juli 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Lorenz, Reinhard