Dissecting the role of NELL-ligands and their possible receptors in myogenesis

Kruse, Julian (2023): Dissecting the role of NELL-ligands and their possible receptors in myogenesis. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Myogenesis, the formation of skeletal muscle, occurs in four sequential, partially overlapping phases. Muscle precursor cells (MPCs) first proliferate, then migrate, differentiate, and fuse to myotubes. This spatiotemporal process is highly complex, and thus MPCs are subject to various autocrine and paracrine differentiation and migration signals. Non-myogenic muscle cells (nMMCs), such as fibroblasts or motor neurons, have also been shown to influence MPCs through several ligand-receptor pathways. Nel-related protein 1 (NELL1) and NELL2 are two ligands mainly investigated in their role in neuronal development, osteogenesis, and various tumors. More distinctively, NELL1 was shown to improve the constructive remodeling outcome in muscle injury models. In addition, NELL2 offers an interesting differential expression profile during early myogenesis. Furthermore, the Roundabout (ROBO) receptor family are the only currently known NELL receptors, and ROBOs were demonstrated to be involved in myoblast guidance and alignment. Therefore, I hypothesized that NELLs might be promising candidates that differentially influence myogenesis. Furthermore, I hypothesized that NELLs affect the cells involved in myogenesis by binding to receptors of the ROBO family. In this study, I used a gene expression-based approach and in vitro studies to examine these potentially important ligands for myogenesis. To explore the expression profile of NELLs in myogenic (MMCs) and non-myogenic muscle cells (nMMCs) separately, I bred the myogenic reporter mouse line Rosa26mT/mG;Acta1Cre. Comparison to other myogenic sequencing data revealed that NELL2 is weakly expressed by E15.5 nMMCs. During migration, myoblasts express NELL2 strongly, while interestingly, NELL2 is downregulated in early fusion. The effect of NELLs on myoblasts during various stages of myogenesis was assessed using recombinant proteins (RP) and SCP1RFP;NELL2::AP conditioned media on C2C12 cells in random migration, directed migration, alignment, and fusion assays. Aligning with the expression profile, a pro- migratory effect of NELL2 was recognized, while NELL1 was not observed to influence myoblast migration. No chemotaxis effect of NELLs on directing myoblast migration was observed. Also, no evidence of a NELL influence on alignment or fusion of C2C12 cells was shown. In sum, I identified NELL2 as a new pro-migratory ligand in myogenesis. Myoblasts during the migration phase express NELL2, which seems to work in an autocrine or paracrine manner. By NELL2 binding, C2C12 cells move slightly faster, while fusion appears to be inhibited. Future experiments should concentrate on further dissecting the effect of NELL2 on myogenesis and aim to identify if the influence is enabled by ROBO2 or another myoblast receptor.

Abstract

Myogenese, die Entwicklung der Skelettmuskulatur, erfolgt in vier aufeinander folgenden, sich teilweise überlappenden, Phasen. Zuerst proliferieren Muskelvorläuferzellen (MPCs), dann migrieren, differenzieren und fusionieren diese zu Myotuben. Dieser raumzeitliche Prozess ist hochkomplex, so dass MPCs verschiedenen autokrinen und parakrinen Differenzierungs- und Migrationssignalen unterliegen. Es wurde außerdem gezeigt, dass auch nicht-myogene Zellarten (nMMCs) wie Fibroblasten oder Motoneurone, MPCs über verschiedene Liganden- Rezeptor Signalwege beeinflussen. Nel-related protein 1 (NELL1) und NELL2 sind zwei Liganden, deren Rolle hauptsächlich in der neuronalen Entwicklung, Osteogenese und verschiedenen Tumoren untersucht wurden. Es hat sich jedoch auch gezeigt, dass NELL1 das Ergebnis des konstruktiven Umbaus in Muskelverletzungsmodellen verbessert. Darüber hinaus weist NELL2 ein interessantes differentielles Expressionsprofil in der frühen Myogenese auf. Zudem sind die Rezeptoren der Roundabout-Familie (ROBO) die einzigen derzeit bekannten NELL-Rezeptoren, und es wurde gezeigt, dass ROBOs an der Chemotaxis und Ausrichtung der Myoblasten beteiligt sind. Daher stellte ich die Hypothese auf, dass NELLs vielversprechende Signale sind, welche die Myogenese differenzial beeinflussen. Außerdem stellte ich die Hypothese auf, dass NELLs, die an der Myogenese beteiligten Zellen durch die Bindung an Rezeptoren der ROBO-Familie modulieren. In dieser Studie habe ich eine Genexpressionsanalyse zusammen mit in-vitro Studien verwendet, um diese potenziell wichtigen myogenese Liganden zu untersuchen. Um das Expressionsprofil von NELLs in myogenen (MMCs) und nicht-myogenen Muskelzellen (nMMCs) getrennt zu untersuchen, habe ich die myogene Reportermauslinie Rosa26mT/mG;Acta1Cre gezüchtet. Ein Vergleich mit anderen myogenen Sequenzierungsdaten ergab, dass NELL2 von E15.5 nMMCs nur schwach exprimiert wird. In der Migrationsphase exprimieren Myoblasten NELL2 stark, währenddessen interessanterweise, die NELL2 Expression in der frühen Fusion herunterreguliert wird. Der Einfluss von NELLs auf Myoblasten in den verschiedenen Stadien der Myogenese wurde mit rekombinanten Proteinen und SCP1RFP;NELL2::AP konditioniertem Medium auf C2C12-Zellen in zufälligen Migrations-, gerichteten Migrations-, Ausrichtungs- und Fusionsversuchen untersucht. In Übereinstimmung mit dem Expressionsprofil wurde eine migrationsfördernde Wirkung von NELL2 festgestellt, während NELL1 die Migration nicht beeinflusste. Es wurde kein Chemotaxis-Effekt von NELLs auf die direktionale Migration beobachtet. Auch ein Einfluss von NELL auf die Ausrichtung oder Fusion von C2C12-Zellen konnte nicht nachgewiesen werden. Zusammengefasst, habe ich NELL2 als neues Migrationssignal in der Myogenese identifiziert. Myoblasten exprimieren während der Migrationsphase NELL2, das autokrin oder parakrin zu agieren scheint. Durch eine Bindung an NELL2, migrieren die C2C12-Zellen etwas schneller, während sich eine nicht signifikante Hemmung der Fusion präsentiert. Weitere Studien sollten sich darauf konzentrieren, die Wirkung von NELL2 auf die Myogenese genauer zu untersuchen und herauszufinden, ob der Einfluss durch ROBO2 oder einen anderen Rezeptor ermöglicht wird.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 27. Juli 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Böcker, Wolfgang