Generation and characterization of CD19 CAR T cells with CTLA-4/CD28 fusion receptor

Mahdawi, Jasmin (2023): Generation and characterization of CD19 CAR T cells with CTLA-4/CD28 fusion receptor. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Adoptive transfer of CD19 specific T cells with a chimeric antigen receptor (CAR) has revolutionized anti-cancer therapy for patients with advanced B-precursor acute lymphoblastic leukemia (ALL). Unprecedented response rates up to 90% have been observed in clinical trials and resulted in FDA approvals. Nevertheless, 50% of the patients treated with anti-CD19 CAR T cells suffer from relapse within 24 months. This emphasizes the need to elucidate mechanisms that lead to success or failure of CAR T cell therapy and provide a potential strategy to overcome possible escape mechanisms. In this study, the immune checkpoint profiles of leukemic cell lines and CAR T cells were analyzed before and after activation. A significant increase in mean surface expression of inhibitory surface markers like PD-L1, TIM-3 and CTLA-4 was observed in CD19 specific CAR T cells after target cell recognition. Next, we detected that overexpression of CTLA-4 on CAR T cells leads to diminished activation and proliferation potential upon antigen stimulation. To circumvent the suppressing effect of CTLA-4, CAR T cells with a CTLA-4/CD28 fusion receptor were designed. The fusion receptor contains the extracellular and transmembrane domain of CTLA-4 fused to the intracellular domain of CD28, which is meant to turn the inhibitory CTLA-4 signal into CD28-mediated T cell stimulation. First generation CAR T cells with (19_3z_CTLA_28) and without (19_3z) fusion receptor and second generation CAR T cells (19_3z_BB) were successfully generated via retroviral transduction and characterized by flow cytometry. High viability and expansion as well as a favorable stem-cell/central memory like phenotype were observed. In vitro functionality assays of 19_3z_CTLA_28 revealed strong CD19-dependent activation, proliferation and killing capacities as well as high IFN-γ and TNF-α secretion upon target cell contact. Inclusion of the fusion receptor did not impair activation capability of conventional first generation CAR T cells. Comparably high killing capacities were detected for all tested CAR T cell constructs. CAR T cells with fusion receptor showed slightly increased cytokine secretion in presence of CD80/CD86 on target cells. To assess long-term anti-tumor efficacy, CAR T cells with and without fusion receptor were stimulated repetitively with CD19+ CD80+ CD86+ target cells over a time period of 19 days. Upon serial stimulation, 19_3z_CTLA_28 showed stable killing potency as well as significantly higher killing percentages compared to conventional first generation CAR T cells. In vivo functionality of CAR T cells with a CTLA-4/CD28 fusion receptor will have to be addressed in future studies. The incorporation of fusion receptors into CAR T cells could be a promising strategy to optimize CAR T cell therapy for treatment of advanced pediatric leukemia and relapse-prone patients.

Abstract

Der adoptive Transfer von CD19-spezifischen T-Zellen mit chimärem Antigenrezeptor (CAR) hat die Therapie der fortgeschrittenen B-Vorläufer ALL revolutioniert. Hohe initiale Ansprechraten bis zu 90% resultierten in der Zulassung in den USA und in Europa. Nichtsdestotrotz erleiden 50% der mit anti- CD19 CAR-T-Zellen behandelten Patienten innerhalb von 24 Monaten einen Rückfall. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, Mechanismen aufzuklären, die zum Erfolg oder Misserfolg der CAR- T-Zelltherapie führen, sowie eine mögliche Strategie zur Überwindung dieser Mechanismen bereitzustellen. In diesem Projekt wurden die Immuncheckpoint-Profile von Leukämiezelllinien und CAR-T-Zellen vor und nach Aktivierung analysiert. Eine signifikante Zunahme der Expression inhibitorischer Oberflächenmarker wie PD-L1, TIM-3 und CTLA-4 wurde auf CD19-spezifischen CAR-T-Zellen nach Erkennung der Zielzellen beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von CTLA-4 auf CAR-T-Zellen, nach Antigenstimulation, zu einem verminderten Aktivierungs- und Proliferationspotential führt. Um den hemmenden Effekt von CTLA-4 zu umgehen, wurden CAR-T-Zellen mit einem CTLA-4/CD28 Fusionsrezeptor entwickelt. Dieser Rezeptor enthält eine extrazelluläre CTLA-4- und eine intrazelluläre CD28-Domäne, wodurch das inhibitorische CTLA-4-Signal in eine CD28-vermittelte T-Zell-Stimulation umgewandelt werden soll. Erst-Generations CAR-T-Zellen mit (19_3z_CTLA_28) und ohne (19_3z) Fusionsrezeptor sowie Zweit-Generations CAR-T-Zellen (19_3z_BB) wurden mittels retroviraler Transduktion erfolgreich generiert und durchflusszytometrisch charakterisiert. Hohe Viabilität, gute Expansionsfähigkeit und ein mehrheitlich Stammzell-/Gedächtniszell-Phänotyp wurden beobachtet. In vitro Funktionalitätstests des 19_3z_CTLA_28 zeigten eine starke CD19-abhängige Aktivierung, Proliferation und Zytotoxizität sowie eine hohe IFN-γ und TNF-α Sekretion bei Zielzellenkontakt. Der Einbau des Fusionsrezeptors beeinträchtigte nicht die Aktivierungsfähigkeit konventioneller CAR-T- Zellen der ersten Generation. Vergleichbar hohe Zytotoxizität wurde für alle getesteten CAR-T- Zellkonstrukte nachgewiesen. In Gegenwart von CD80/CD86 auf Zielzellen zeigten CAR T-Zellen mit Fusionsrezeptor eine leicht erhöhte Zytokinausschüttung. Zur Beurteilung der langfristigen anti-Tumor Effektivität wurden CAR-T-Zellen mit und ohne Fusionsrezeptor über einen Zeitraum von 16 Tagen wiederholt mit CD19+ CD80+ CD86+ Zielzellen stimuliert. Bei wiederholter Stimulation zeigte 19_3z_CTLA_28 eine stabile sowie signifikant höhere Zytotoxizität im Vergleich zu konventionellen CAR-T-Zellen der ersten Generation. Die in vivo Funktionalität von CAR-T-Zellen mit CTLA 4/CD28 Fusionsrezeptor wird in zukünftigen Studien untersucht werden müssen. Der Einbau von Fusionsrezeptoren in CAR-T-Zellen könnte eine vielversprechende Strategie zur Optimierung der CAR-T-Zelltherapie bei der Behandlung von fortgeschrittener pädiatrischer Leukämie und Hochrisiko-Patienten darstellen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: CAR T cells, fusion receptor, CTLA-4, immunotherapy, ALL
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 22. Juni 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Feuchtinger, Tobias