Single-cell transcriptome analyses of dorsal root ganglia in aged hyperlipidemic mice

Lu, Shu (2023): Single-cell transcriptome analyses of dorsal root ganglia in aged hyperlipidemic mice. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Atherosclerosis is the pathology underlying most causes of death worldwide and has been shown to be associated with a major restructuring of the peripheral nervous system (PNS) that initiates an artery brain circuit (ABC). The murine ABC sensor, i.e. the afferent arm of the ABC, connects diseased arteries with dorsal root ganglia (DRGs) that enter the spinal cord (SC) to reach higher brain areas where the electrical signals derived from the diseased arteries are received by sensory brain neurons along the pain pathway. However, the molecular alterations and restructuring of the ABC sensor during atherosclerosis remain unknown. The major goal of this thesis was to explore the uncharted territory of PNS inflammation in atherosclerosis by using single-cell sequencing (scRNA-seq) of the ABC sensor as a model in atherosclerotic mice. The first and painstaking part of the thesis consisted of setting up methods to rule out artifacts, such as blood contamination and tissue contamination from surrounding blood vessels and meninges. Subsequently, faithful and controlled protocols to prepare single cell preparations of DRGs and SCs were established. After achieving this milestone as a requirement for scRNA-seq analyses of the ABC sensor, FACS analyses of the DRGs and SCs combined with immunohistochemical analyses were shown to yield a series of major results. It was found that aging in healthy mice led to immune cell infiltration of DRGs and SCs in the absence of atherosclerosis, but the development of advanced atherosclerosis led to a significant further increase of immune cells in the DRGs and the SCs when young, adult and aged mice were compared. Concurrently, the scRNA-seq body of data were analyzed by a variety of algorithms including cell type clustering and the prediction of cell-cell interactions through ligand-receptor pairs between neurons and non-neuronal cells, such as endothelial cells, fibroblasts, Schwann cells, and leukocytes that emerge in the PNS during atherosclerosis progression. These data allowed to construct transcriptome maps of the multiple neuron and immune cell types together with other non-neuronal cells of the ABC sensor. However, given that a variety of neurons identified in DRGs were rare, a limitation of this work was that these cells - while potentially important - could not be subjected to several types of algorithms. When taken together, our data have revealed major aging- and atherosclerosis-associated changes in neurons and non-neuronal cell transcriptomes of the initial portions of the ABC sensor. We propose that this data provides a solid foundation to define the role of atherosclerosis in shaping the ABC during aging and atherosclerosis. Such future studies together with the current data will enable us to address the long-term goal as physicians to develop new therapeutic approaches to prevent and treat this treacherous and deadly disease.

Abstract

Atherosklerose, die der Pathologie der Mehrzahl der Herzkreislauferkrankungen mit den meisten Todesursachen weltweit zugrunde liegt ist mit einer umfassenden Umstrukturierung des peripheren Nervensystems (PNS) assoziiert. Kürzlich wurde von unserer Arbeitsgruppe eine direkte Nervenverschaltung erkrankter Arterien mit dem Gehirn entdeckt, die wir als artery brain circuit (ABC) bezeichnet haben. Der murine ABC-Sensor, d.h. der afferente Arm des ABC, verbindet erkrankte Arterien mit dorsalen Wurzelganglien (DRGs), die in das Rückenmark (SC) eintreten, um höhere Hirnregionen zu erreichen, in denen die elektrischen Signale, die von den erkrankten Arterien erzeugt werden, von sensorischen Hirnneuronen entlang des Schmerzwegs empfangen werden. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, das unerforschte Gebiet der PNS-Entzündung bei Atherosklerose mittels Einzelzellsequenzierung (scRNA-seq) des ABC-Sensors als Modell bei atherosklerotischen Mäusen zu untersuchen. Der erste und mühsame Teil der Arbeit bestand darin, Methoden zum Ausschluss von Artefakten wie Blutkontamination und Gewebekontamination aus umliegenden Blutgefäßen und Meningen zu entwickeln, um bona fide Einzelzellsuspensionen hoher Qualität zu präparieren. Anschließend wurden Protokolle zur Herstellung von Einzelzellpräparationen von Wuzelganglien und Rückenmark etabliert. Nach Erreichen dieses Meilensteins als Voraussetzung für scRNA-seq-Analysen des ABC-Sensors ergaben FACS-Analysen in Kombination mit immunhistochemischen Analysen eine Reihe von bedeutenden Ergebnissen. Es wurde beobachtet, dass das Altern bei gesunden Mäusen zur Infiltration von Immunzellen in Wuzelganglien und Rückenmark bereits ohne Atherosklerose führte, aber die Entwicklung von fortgeschrittener Atherosklerose in alten Mäusen zu einer signifikanten weiteren Zunahme von Immunzellen führte. Die scRNA-seq Daten wurden anschließend mit einer Vielzahl von Algorithmen analysiert, einschließlich der Zelltyp-Clustering und der Vorhersage von Zell-Zell-Interaktionen durch Ligand-Rezeptor Identifikation in silico zwischen Neuronen und nichtneuronalen Zellen wie Endothelzellen, Fibroblasten, Schwann-Zellen und Leukozyten, die im PNS während der Atherosklerose-Progression zu beobachten sind. Diese Daten ermöglichten die Erstellung von Transkriptomkarten der verschiedenen Neuronen- und Immunzelltypen zusammen mit anderen nichtneuronalen Zellen des ABC-Sensors. Eine Einschränkung dieser Arbeit bestand darin, dass einige Neuronensubpopulationen, die im Nervensystem identifiziert wurden, selten waren und diese Zellen - obwohl potenziell wichtig - nicht mehreren Algorithmustypen unterzogen werden konnten. Insgesamt haben unsere Daten bedeutende die Voraussetzungen geschaffen, das gesamte Nervensystem während des Alterns und in Abhängigkeit der Atherosklerose zu kartieren. Die hier berichteten Daten bilden die Grundlage für funktionelle Untersuchungen in der Maus und im Menschen, um die Interaktionen zwischen dem Nervensystem und der Atheroklerose zu definieren.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 13. Juli 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Habenicht, Andreas