Relevanz des ultragroßen und thrombozytären von Willebrand Faktors für die primäre Hämostase und in der Diagnostik des von Willebrand Syndroms

Kragh, Thorsten (2023): Relevanz des ultragroßen und thrombozytären von Willebrand Faktors für die primäre Hämostase und in der Diagnostik des von Willebrand Syndroms. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Die primäre Hämostase kann als Abfolge von Thrombozyten und Protein Interaktionen beschrieben werden. Das Zusammenspiel mit dem von Willebrand Faktor (VWF) ist dabei unerlässlich. Um der Komplexität gerecht zu werden, die hinter diesem stark regulierten System steckt, muss die Mikroumgebung um eine Gefäßläsion betrachtet werden. Es spielt die initiale Phase, in der ein zeitlich und räumlich eng begrenztes, hoch thrombogenes Milieu geschaffen wird, eine wichtige Rolle. Es entsteht um Mikroläsionen des Endothels, ist aber kaum durch gängige Messmethoden erfassbar. Durch die Messung einzelner Parameter können dennoch klinisch relevante Rückschlüsse gezogen werden. Die Konzentration und Aktivität des VWF im Plasma sind Routineparameter bei der Beurteilung von Hämostasestörungen. Neben dem plasmatischen VWF ist bekannt, dass der VWF der Thrombozyten – synthetisiert in Megakaryozyten und gespeichert in den α-Granula der zirkulierenden Blutplättchen – zur primären Hämostase und in der Mikroumgebung der Thrombusbildung beiträgt. Der 2018 auch in der EU zugelassene rekombinante VWF (rVWF) Veyvondi® weist die multimere Verteilung von frisch sezerniertem VWF mit ultragroßen (ULVWF) und hochmolekularen Multimeren aus Endothelzellen und Megakaryozyten auf. Er war weder ADAMTS13 noch einem anderen proteolytischen Enzym ausgesetzt. Die Messung der Verschlusszeit (CT) mit dem Platelet Function Analyzer 200 (PFA-200) erwies sich als hochempfindlich für das Vorhandensein von ULVWF aus zugesetzten VWF-Konzentraten. Als ähnlich naiv wie der rVWF gegenüber Proteolyse stellt sich nur der VWF in Thrombozyten dar. Die laborchemische Bestimmung des platelet-derived VWF ist allerdings umständlich und hat sich nicht als Routineparameter durchgesetzt. Es wird daher im Rahmen dieser Arbeit eine Methode zur Laborbestimmung und Berichterstattung über den VWF in Thrombozyten vorgeschlagen, die für die Laborroutine und Forschung nützlich sein kann. Aus der Datenbank der Gerinnungsambulanz des LMU Klinikums wurden 12 Patienten mit diagnostizierter schwerer von-Willebrand-Erkrankung (VWD) ausgewählt. Den Vollblutproben der VWD-Patienten wurden in vitro eine therapeutische Dosis des rVWF-Produkts (1 IE/ml) zugesetzt, und die PFA-CTs gemessen. Die PFA-CTs normalisierten sich daraufhin. Darüber hinaus führten steigende Dosierungen von rVWF (0,1; 0,2; 0,5 und 1,0 IE/ml) zu einer dosisabhängigen Verkürzung der PFA-CT. Die in vitro Daten zeigen, dass der PFA-200 ein nützliches Instrument zum Nachweis von rVWF ist. Da die PFA-CT-Korrektur dosisabhängig ist, könnte der rVWF Spiegel mit dieser Point-of-Care Analysemethode während der Ersatztherapie zuverlässig überwacht werden. Zur Etablierung einer Methode zur Analyse des platelet-derived VWF wurden Thrombozyten aus dem Blut 20 freiwilliger Probanden isolierten. Daraus wurde der platelet-derived VWF extrahierter und ergab die Basis für einen Datensatz, mit deren Hilfe drei mögliche Modelle berechnet wurden. Diese Modelle erlaubten es, den platelet-derived VWF zu beschreiben als 1. die Konzentration des platelet-derived VWF im Vollblut, 2. die Menge des platelet-derived VWF in einer Probe mit einer definierten Konzentration von 1000 Thrombozyten pro Nanoliter und 3. die Konzentration des platelet-derived VWF in einem einzelnen Thrombozyten. Die Ergebnisse legen nahe, dass bei gesunden Personen ein Anteil von 10 % der Aktivität des gesamt VWFs im menschlichen Plasma auf den platelet-derived VWF entfallen. Die Konzentration des platelet-derived VWF wird auf 0,4 IU/ml in einer Probe mit einer definierten Konzentration von 1000 Thrombozyten/nl und auf etwa 42 IU/ml in einem Thrombozyten berechnet (jeweils VWF:Ag). Die Analyse des platelet-derived VWF bleibt methodisch komplex und der Handhabung in spezialisierten Laboren vorbehalten. Dennoch stellt diese und die Detektierbarkeit von ULVWF in VWF-defizientem Blutplasma von Patienten mit schwerer VWD mithilfe eines funktionellen Testgeräts einen Schritt Richtung Beurteilbarkeit der Mikroumgebung dar. Der PFA-200 als eine vollautomatische und zuverlässige Point-of-Care-Methode zur Bewertung der primären Hämostase, kann erheblichen klinischen Nutzen bringen. Eingesetzt zur Überwachung der rVWF-Ersatztherapie bei Patienten mit VWD, bietet er die Möglichkeit, Dosierungen des rVWF zu optimieren und trägt damit zur Patientensicherheit bei. Experimentell konnte gezeigt werden, dass Vollblutproben von VWD-Patienten, die mit rVWF versetzt wurden, eine Normalisierung im PFA-CT aufwiesen und dass eine Dosis-Wirkungs-Beziehung bestand. Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten zur Optimierung der diagnostischen Verfahren hinsichtlich des von Willebrand Faktors beitragen. Somit würden sie einen potentiellen Beitrag zum besseren Verständnis dieses Schlüsselproteins der primären Hämostase leisten.

Abstract

Primary hemostasis can be described as a sequence of platelet and protein interactions, in which the interplay with von Willebrand factor (VWF) is essential. To account for the complexity behind this highly regulated system, the microenvironment surrounding a vascular lesion must be considered. In this context, the initial phase, in which a temporally and spatially confined, highly thrombogenic milieu is created, plays an important role. It develops around microlesions of the endothelium, but is hardly detectable by common laboratory methods. Nevertheless, clinically relevant conclusions can be drawn by measuring individual parameters. The concentration and activity of VWF in plasma are routine parameters in the assessment of hemostasis disorders. In addition to VWF in plasma, VWF in platelets, synthesized by megakaryocytes and stored in the α-granules of circulating platelets, is known to contribute to primary hemostasis and in the microenvironment of thrombus formation. Veyvondi®, a recombinant VWF (rVWF), approved in 2018 also in the EU, exhibits the multimeric distribution of freshly secreted VWF with ultralarge (ULVWF) and high molecular weight multimers from endothelial cells and megakaryocytes, as it was not exposed to ADAMTS13 or any other proteolytic enzyme. Closure time (CT) measurement with the Platelet Function Analyzer 200 (PFA-200) was found to be highly sensitive to the presence of ULVWF from added VWF concentrates. Only VWF in platelets was found to be similarly to rVWF naive to proteolysis. However, laboratory determination of platelet-derived VWF is cumbersome and has not gained acceptance as a routine parameter. Therefore, a method for laboratory determination and reporting of VWF in platelets that might be useful for routine laboratory work and research is proposed in this work. Twelve patients diagnosed with severe von Willebrand disease (VWD) were selected from the database of the Hemophilia Treatment Center of LMU Klinikum. A therapeutic dose of rVWF product (1 IU/ml) was added to the VWD patients' whole blood samples in vitro, and PFA-CTs were measured. PFA-CTs subsequently normalized. In addition, increasing doses of rVWF (0.1; 0.2; 0.5 and 1.0 IU/ml) resulted in a dose-dependent shortening of PFA-CTs. The in vitro data indicate that the PFA-200 is a useful tool for detecting rVWF. Because PFA-CT reduction is dose-dependent, rVWF levels could be reliably monitored by this point-of-care analysis method during replacement therapy. To establish a method for analysis of platelet-derived VWF, platelets were isolated from the blood of 20 volunteers. From these, platelet-derived VWF was extracted and provided the basis for a data set that was used to calculate three alternative models. These models allowed platelet-derived VWF to be described as 1. the concentration of platelet-derived VWF in whole blood, 2. the amount of platelet-derived VWF in a sample with a defined concentration of 1000 platelets per nanolitre, and 3. the concentration of platelet-derived VWF in a single platelet. The results suggest that in healthy individuals, platelet-derived VWF accounts for 10% of the activity of total VWF in human plasma. The concentration of platelet-derived VWF is calculated to be 0.4 IU/ml in a sample with a defined concentration of 1000 platelets/nl and approximately 42 IU/ml in a platelet (VWF:Ag, respectively). Analysis of platelet-derived VWF remains methodologically complex and confined to specialized laboratories for handling. Nevertheless, this and the detectability of ULVWF in VWF-deficient plasma from patients with severe VWD using a functional analyzer is a step toward assessability of the microenvironment. The PFA-200, as a fully automated and reliable point-of-care method for assessing primary hemostasis, may provide significant clinical benefit. Used to monitor rVWF replacement therapy in patients with VWD, it provides the ability to monitor and optimize regimens of rVWF, contributing to patient safety. Experimentally, it was shown that whole blood samples from VWD patients spiked with rVWF exhibited normalization in PFA-CT and that a dose-response relationship existed. The results of this work may contribute to the optimization of diagnostic procedures with regard to von Willebrand factor. Thus, they would potentially provide a contribution to a better understanding of this key protein of primary hemostasis.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: von Willebrand factor, platelet-derived VWF, microenvironment
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 11. Mai 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Spannagl, Michael