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Untersuchung der Funktion von Hyaluronan und Hyaluronansynthasen im Knochen eines Mausmodells für „Osteogenesis Imperfecta“ und im Knochen von osteoporotischen Patienten
Untersuchung der Funktion von Hyaluronan und Hyaluronansynthasen im Knochen eines Mausmodells für „Osteogenesis Imperfecta“ und im Knochen von osteoporotischen Patienten
Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein essenzieller Bestandteil von verschiedenen Geweben sowie Flüssigkeiten des Körpers. Als membranständiges Glykosaminoglykan kommt HA ubiquitär, extrazellulär, intrazellulär sowie perizellulär im Körper vor. Drei Hyaluronansynthasen (HAS1, HAS2, HAS3) produzieren HA. Hyaluronidasen sind für den Hyaluronanabbau verantwortlich. HA soll die Funktion von Osteoklasten, Osteoblasten und Osteozyten kontrollieren. Somit scheint HA das Remodeling von Knochen zu regulieren. Die endgültige Funktion der Hyaluronan-Synthasen und des Hyaluronans in der Knochenhomöostase sowie deren Rolle in der Pathogenese der degenerativen Knochenerkrankungen sind noch nicht ausführlich untersucht. Methoden: Für das Ziel der Arbeit wurde eine Methode der Aufreinigung und Kultivierung der murinen mesenchymalen Stammzellen etabliert. Im Labor wurde auch eine Methode entwickelt, um Hyaluronan aus den humanen Hüftköpfen der osteoporotischen und nicht-osteoporotischen Patienten zu extrahieren. Der Hyaluronangehalt wurde mithilfe eines kommerziellen ELISA-Kits bestimmt. Die hMSCs wurden direkt aus dem Knochenmaterial der Hüftköpfe isoliert. Das von den hMSCs in den Zellkulturüberstand abgegebene HA wurde mittels ELISA quantifiziert. Mittels sowohl eines biotinylierten HA-Bindeproteins als auch eines mit einem Fluorophor-konjugierten Streptavidins wurde der perizelluläre HA-Mantel gefärbt und verglichen. Ergebnisse: Es wurde ein Protokoll zur Aufreinigung und Kultivierung von murinen mesenchymalen Stammzellen (mMSCs) erfolgreich etabliert. Die isolierten Zellen konnten sich zu Osteoblasten, Adipozyten sowie Chondrozyten differenzieren. Die mMSCs weisen ein spezifisches Expressionsprofil von Oberflächenmarkern auf, welches in einer FACS-Analyse nachgewiesen werden konnte. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass die mMSCs alle drei HAS-Isoenzyme exprimieren. Mittels der ELISA-Methode wurde nachgewiesen, dass der HA-Gehalt in den osteopenen bzw. nicht-osteoporotischen Knochen im Vergleich zu den osteoporotischen Knochen erhöht ist. Dagegen ist die HA-Konzentration in den Zellüberständen aus den Zellen nicht-osteoporotischer Patienten im Mittel geringer als in den Zellüberständen aus den Zellen osteoporotischer Patienten. Der Vergleich der Fluoreszenzsignale zwischen den hMSCs aus den osteoporotischen und nicht-osteoporotischen Zellen zeigte keinen Unterschied in der Intensität. Schlussfolgerung: Die etablierte Methode zur Aufreinigung und Kultivierung der mMSCs für weiterführende Untersuchungen des Hyaluronans sowie Hyaluronansynthasen unter anderem im Mausmodell „Osteogenesis imperfecta“ kann erfolgreich unter Laborbedingungen eingesetzt werden. Der Nachweis der HAS- sowie Hyaluronanfunktion kann für zukünftige Therapieoptionen bei Osteoporose, Osteogenesis imperfecta sowie anderen degenerativen Erkrankungen eine grundlegende Rolle spielen.
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Kornyeva, Anastasiya
2023
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Kornyeva, Anastasiya (2023): Untersuchung der Funktion von Hyaluronan und Hyaluronansynthasen im Knochen eines Mausmodells für „Osteogenesis Imperfecta“ und im Knochen von osteoporotischen Patienten. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein essenzieller Bestandteil von verschiedenen Geweben sowie Flüssigkeiten des Körpers. Als membranständiges Glykosaminoglykan kommt HA ubiquitär, extrazellulär, intrazellulär sowie perizellulär im Körper vor. Drei Hyaluronansynthasen (HAS1, HAS2, HAS3) produzieren HA. Hyaluronidasen sind für den Hyaluronanabbau verantwortlich. HA soll die Funktion von Osteoklasten, Osteoblasten und Osteozyten kontrollieren. Somit scheint HA das Remodeling von Knochen zu regulieren. Die endgültige Funktion der Hyaluronan-Synthasen und des Hyaluronans in der Knochenhomöostase sowie deren Rolle in der Pathogenese der degenerativen Knochenerkrankungen sind noch nicht ausführlich untersucht. Methoden: Für das Ziel der Arbeit wurde eine Methode der Aufreinigung und Kultivierung der murinen mesenchymalen Stammzellen etabliert. Im Labor wurde auch eine Methode entwickelt, um Hyaluronan aus den humanen Hüftköpfen der osteoporotischen und nicht-osteoporotischen Patienten zu extrahieren. Der Hyaluronangehalt wurde mithilfe eines kommerziellen ELISA-Kits bestimmt. Die hMSCs wurden direkt aus dem Knochenmaterial der Hüftköpfe isoliert. Das von den hMSCs in den Zellkulturüberstand abgegebene HA wurde mittels ELISA quantifiziert. Mittels sowohl eines biotinylierten HA-Bindeproteins als auch eines mit einem Fluorophor-konjugierten Streptavidins wurde der perizelluläre HA-Mantel gefärbt und verglichen. Ergebnisse: Es wurde ein Protokoll zur Aufreinigung und Kultivierung von murinen mesenchymalen Stammzellen (mMSCs) erfolgreich etabliert. Die isolierten Zellen konnten sich zu Osteoblasten, Adipozyten sowie Chondrozyten differenzieren. Die mMSCs weisen ein spezifisches Expressionsprofil von Oberflächenmarkern auf, welches in einer FACS-Analyse nachgewiesen werden konnte. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass die mMSCs alle drei HAS-Isoenzyme exprimieren. Mittels der ELISA-Methode wurde nachgewiesen, dass der HA-Gehalt in den osteopenen bzw. nicht-osteoporotischen Knochen im Vergleich zu den osteoporotischen Knochen erhöht ist. Dagegen ist die HA-Konzentration in den Zellüberständen aus den Zellen nicht-osteoporotischer Patienten im Mittel geringer als in den Zellüberständen aus den Zellen osteoporotischer Patienten. Der Vergleich der Fluoreszenzsignale zwischen den hMSCs aus den osteoporotischen und nicht-osteoporotischen Zellen zeigte keinen Unterschied in der Intensität. Schlussfolgerung: Die etablierte Methode zur Aufreinigung und Kultivierung der mMSCs für weiterführende Untersuchungen des Hyaluronans sowie Hyaluronansynthasen unter anderem im Mausmodell „Osteogenesis imperfecta“ kann erfolgreich unter Laborbedingungen eingesetzt werden. Der Nachweis der HAS- sowie Hyaluronanfunktion kann für zukünftige Therapieoptionen bei Osteoporose, Osteogenesis imperfecta sowie anderen degenerativen Erkrankungen eine grundlegende Rolle spielen.