Description and optimization of a multiplex bead-based flow cytometry method (MBFCM) to characterize extracellular vesicles in serum or culture supernatants samples from patients with hematological malignancies

Li, Lin (2023): Description and optimization of a multiplex bead-based flow cytometry method (MBFCM) to characterize extracellular vesicles in serum or culture supernatants samples from patients with hematological malignancies. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

EVs are membranous vesicles and their role in tumor or immune activation could contribute to evaluate and monitor antileukemic processes. EVs were isolated from serum of AML, ALL, CLL patients and healthy volunteers. Typical cup-shaped appearance of serum EVs was identified by TEM and EV concentrations and size distribution profiles of purified serum EVs were characterized by fNTA. EV markers (CD81, CD63, CD9) and lineage associated EV markers CD8, CD42a, CD62P and HLA-DRDPDQ were highly expressed in AML, AML, CLL and Healthy samples evaluated by MBFCM (using 37 specific markers). Our data detected correlations of serum-derived EV marker expressions (detected by MBFCM) with immune cytologically detected leukemic cells, platelet and white blood cell counts in all AML, ALL and CLL samples. Especially, high frequencies of EVs coexpression CD81, CD63, CD9 and in addition CD8, CD41b, CD42a, CD62P, HLA-DRDPDQ and SSEA-4 (as evaluated by MBFCM) were found in AML and Healthy samples. Total RNA was isolated from EVs via small RNA sequencing for qualitative/quantitative characterization from AML and Healthy samples. Up regulated miRNAs (miR-10a-5p, miR-155-5p, miR-100-5p, miR-146b-5p, let-7a-5p) and down regulated miRNAs (miR-185-5p, miR-4433b-3p, miR-199a-5p, miR-451a, miR-151a-3p) derived from EVs in AML vs healthy samples were found. We were able to work out several promising and exciting results in the field of EVs/EV de-rived miRNA characterization. In the ongoing project we will apply these methodological strategies to deduce more interesting results using culture supernatants: After generation of DC/DCleu with Kit M (GM-CSF and PGE1) from leukemic WB, DC and DCleu containing WB lead to specifically stimulated anti-leukemic (T)-cells after T-cell enriched MLC, giving rise to improved anti-leukemic immune response. EVs were isolated from DC and MLC culture supernatants of AML patients and healthy volunteers. In our ongoing study, we will precede and further characterize and compare EV compositions before or after DC/MLC culture supernatants with or without Kit M. We want to evaluate or identify, whether EVs could undergo modulations during DC or MLC culture. From this proof-of-concept study using serum or culture supernatants, MBFCM provided more insight into general expression of EV surface markers from leukemia patients and could support some starting points for future studies. Moreover, analyses of EVs and EV derived miRNAs, as novel non-invasive markers, could contribute to (sub)classify leukemia and to predict outcome and response to treatment for leukemia.

Abstract

EVs sind membranöse Vesikel und ein Verständnis ihrer Rolle bei der Tumorentstehung oder Immunaktivierung könnte dazu beitragen, antileukämische Prozesse zu verstehen und zu monitorieren. EVs wurden aus dem Serum von AML-, ALL-, CLL-Patienten und gesun-den Proben isoliert. Das typische becherförmige Erscheinungsbild von Serum-EVs wurde durch TEM identifiziert, und EV-Konzentrationen und Größen von Serum-EVs durch fNTA ermittelt. Hohe Anteile an EVs (positiv für CD81, CD63, CD9), die linienassoziierte EV-Marker exprimieren (CD8, CD42a, CD62P und HLA-DRDPDQ ) wurden in AML-, AML-, CLL- und gesunden Serum-Proben mit Hilfe von MBFCM (unter Verwendung von 37 spezifischen Markern) detektiert. Unsere Daten zeigten Korrelationen von EV-Markerexpressionen (ge-messen durch MBFCM) in Serum mit immunzytologisch nachgewiesenen Leukämiezellen, Blutplättchen- und Leukozytenzahlen in allen AML-, ALL- und CLL-Proben. Insbesondere wurden in AML- und gesunden Proben mit MBFCM hohe Anteile an EVs (po-sitiv für CD81, CD63, CD9) gefunden, die zusätzlich CD8, CD41b, CD42a, CD62P, HLA-DRDPDQ und SSEA-4 exprimierten. Gesamt-RNA wurde aus EVs über ‚small RNA‘ Sequen-zierung zur qualitativen/quantitativen Charakterisierung von AML- und gesunden Proben isoliert: In AML vs gesunden Serum-EVs wurden hochregulierte miRNAs (miR-10a-5p, miR-155-5p, miR-100-5p, miR-146b-5p, let-7a-5p) und herunterregulierte miRNAs (miR-185-5p, miR-4433b-3p , miR-199a-5p, miR-451a, miR-151a-3p) detektiert. Wir konnten mehrere vielversprechende und spannende Ergebnisse zur EV - und (aus EV präparierten) miRNA Charakterisierung erarbeiten. In den laufenden Projekten werden wir diese methodischen Strategien anwenden, um neue Ergebnisse aus Kulturüberständen zu generieren.: Nach der Generierung von DC/DCleus mit Kit M (GM-CSF und PGE1) aus leukämischem Vollblut konnten wir zeigen, dass nach T-Zell-angereicherter MLC mit DC/DCleu-haltigen Proben leukämiespezifische/ anti-leukämischen T-zellen entstanden. Dies führte zu einer verbesserten anti-leukämischen Immunantwort. EVs wurden aus DC- und MLC-Kulturüberständen von AML-Patienten und gesunden Probanden isoliert. In unserer aktuel-len Studie werden wir EV-Zusammensetzungen vor vs nach DC/MLC- Kultur mit oder ohne Kit M-Einfluss in den -Kulturüberständen weiter charakterisieren und vergleichen. Wir möch-ten herausfinden, ob EVs während der DC- oder MLC-Kultur Modulationen durchlaufen könnten. Aus dieser Proof-of-Concept-Studie mit Serum- oder Kulturüberständen lieferte MBFCM einen intensiveren Einblick in die Expression von Oberflächenmarkern auf EVs-von Leukä-miepatienten. Dies könnte ein Ausgangspunkt für zukünftige Studien sein. Darüber hinaus könnten Analysen von EVs und miRNAs aus EVs dazu beitragen neue nicht-invasive Mar-ker zur (Sub-)Klassifizierung von Leukämien zu finden, die Vorhersagen zum Therapiean-sprechen oder zum Krankheitsverlauf beitragen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 30. März 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Schmetzer, Helga