Quantitation of SARS-CoV-2 neutralizing antibodies using virus-like particles

Rößler, Johannes (2023): Quantitation of SARS-CoV-2 neutralizing antibodies using virus-like particles. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Neutralizing antibodies specifically block the infection of cells by viruses, such as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Their concentration in the sera of convalescents and vaccinees is therefore a good correlate of protection from COVID-19, the disease caused by this virus. Yet, titers in clinical samples are difficult to assess with conventional virus neutralization tests (cVNTs), as they are often cumbersome and work with the pathogen requires precautions of biological safety level 3. Alternative tests mostly rely on viral vectors with the spike protein (S) as the only structural component of the original virus and are therefore biologically distant. To overcome these issues, this work describes the development of a safe, virus-free, and rapid in vitro diagnostic test, that is based on engineered but authentic virus-like particles (VLPs). The VLPs share all structural features of SARS-CoV-2 except for the viral RNA genome and are thus incapable of replication or reprogramming cells. As they enter susceptible cells via the viral fusion protein S and the respective host cell receptor ACE2, as well as a genuine processing by the protease TMPRSS2, they are nearly ideal functional mimics of the virus and a good model to study viral entry. The VLPs can be traced upon uptake, as they are equipped with an activator peptide that enables immediate enzymatic readout. Neutralizing antibodies induced by infection or vaccination, but also from recombinant sources, interfere with this process and can be reliably quantified within few hours. When tested with a set of COVID-19 patient serum samples, results from this VLP neutralization test (VLPNT) showed excellent sensitivity and specificity and correlated very well with a cVNT using fully infectious SARS-CoV-2. The test was also adapted to variants of concern and demonstrated a reduced neutralizing capacity of sera from vaccinees against B.1.617.2 Delta and B.1.1.529 BA.1 Omicron, as expected. Despite its many advantages, this serologic test requires living cells as VLP recipients. However, it was identified for the first time that VLPs also efficiently fuse with ACE2 bearing extracellular vesicles, following the same tropism. This process was characterized, and the finding utilized to demonstrate the proof-of-concept for a second, novel, virus neutralization tests that does not depend on living cells. Similarly, this assay quantitated neutralizing antibodies and correlated with the cVNT but requires further optimization. Additionally, several S specific neutralizing monoclonal antibodies were generated from immunizations, characterized, and used as reference and molecular tools for this work.

Abstract

Neutralisierende Antikörper sind Proteine des adaptiven Immunsystems, die spezifisch die Infektion von Zellen mit Viren wie SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) verhindern können. Ihre Serumkonzentration im Blut von genesenen und geimpften ist deshalb ein geeignetes Maß für den Schutz vor COVID-19, der durch das Virus verursachten Krankheit. Titer in klinischen Proben sind mit konventionellen Virusneutralisationstests (cVNTs) jedoch schwierig zu bestimmen, da diese oft aufwändig sind und der Umgang mit dem Erreger Sicherheitsvorkehrungen der biologischen Schutzstufe 3 erfordert. Alternativen bedienen sich meist viraler Vektoren, die lediglich das Spike Protein (S) als einzige Komponente des eigentlichen Virus tragen und daher biologisch nur bedingt ähnlich sind. Die vorliegende Dissertation beschreibt die Entwicklung eines sicheren, virusfreien und schnellen in vitro diagnostischen Tests, der auf modifizierten, aber authentischen virusähnlichen Partikeln (VLPs) basiert. Die VLPs enthalten alle strukturellen Merkmale von SARS-CoV-2, mit Ausnahme des viralen RNA-Genoms, weswegen sie nicht in der Lage sind sich zu replizieren oder Zellen umzuprogrammieren. Da sie über das virale Fusionsprotein S und den Rezeptor der Wirtszelle ACE2 in suszeptible Zellen eindringen, nachdem sie von der Protease TMPRSS2 prozessiert wurden, sind sie annähernd ideale funktionelle Abbilder des Virus und ein geeignetes Modell, um dessen Eintritt zu erforschen. Bei ihrer Aufnahme können die VLPs nachverfolgt werden, da sie mit einem Peptid und Aktivator ausgestattet sind, das ein sofortiges enzymatisches Auslesen ermöglicht. Neutralisierende Antikörper, induziert durch Infektion oder Impfung, aber auch aus rekombinanten Quellen, verhindern diesen Prozess und lassen sich daher innerhalb weniger Stunden verlässlich quantifizieren. Ergebnisse mit Serumproben von COVID-19 Patienten belegten die hervorragende Sensitivität und Spezifität des VLP Neutralisationstest (VLPNT) und zeigten eine sehr gute Korrelation mit einem cVNT mit infektiösem Virus. Der Test wurde auch an Virusvarianten angepasst und wies, wie erwartet, eine verringerte Neutralisationskapazität von Seren geimpfter gegenüber B.1.617.2 Delta und B.1.1.529 BA.1 Omikron nach. Trotz seiner vielen Vorteile, benötigt dieser serologische Test lebende Zellen als Akzeptoren für die VLPs. Es konnte jedoch erstmals festgestellt werden, dass VLPs auch effizient mit ACE2 tragenden extrazellulären Vesikeln fusionieren, wobei sie dem gleichen Tropismus folgen. Dieser Prozess wurde charakterisiert und genutzt, um die Machbarkeit eines zweiten neuen Neutralisationstest zu demonstrieren, der ohne lebende Zellen auskommt. Dieser Test korrelierte ebenfalls mit dem cVNT, bedarf jedoch weiterer Optimierung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden außerdem mehrere S-spezifische neutralisierende monoklonale Antikörper durch Immunisierungen generiert, charakterisiert und als molekulare Hilfsmittel eingesetzt.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: SARS-CoV-2, Virus-like particle, VLP, Antibody, Virus neutralization test
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 13. März 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Zeidler, Reinhard