Generation and characterization of CD19 CAR T cells with PD-1_CD28 fusion receptor

Apfelbeck, Antonia Josefine (2022): Generation and characterization of CD19 CAR T cells with PD-1_CD28 fusion receptor. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common malignancy in children. 80 to 90% of the children with standard risk can be cured with chemotherapy and stem cell transplantation. Nevertheless, the prognosis for primary refractory or relapsed ALL is still dismal. As a promising treatment strategy for B-ALL, adoptive T-cell transfer of CD19 targeting T cells with chimeric antigen receptor (CAR) has emerged. Clinical studies show remission rates of heavily pretreated patients of up to 90% upon CAR T-cell infusion. Despite temporary remission, around 50% of patients treated with a conventional anti-CD19 CAR suffer from a relapse. Therefore, CAR T-cell treatment needs to be further optimized. Preliminary data of our group suggested that co-inhibitory checkpoint molecules on the surface of leukemic blasts could prevent T cells from sufficient anti-leukemic response. Here, we designed CAR T cells with a fully human PD-1_CD28 checkpoint fusion receptor. This receptor contains an inhibitory extracellular PD-1 and a stimulatory intracellular CD28 domain. Thus, it is able to reverse the inhibitory PD-1/PD-L1 signal of the leukemic cell into a CD28-based stimulatory signal for the T cell. In this study, we successfully generated first and second generation CAR T cells with and without PD-1_CD28 fusion receptor by retroviral transduction. CAR T cells showed good expansion/ viability and a favourable central/ effector memory phenotype. Functionality assays revealed strong activation, killing and proliferation capacity of anti-CD19 CAR T cells upon target-cell recognition. In line with previous publications, second generation CAR T cells showed improved cytokine release compared to first generation CAR T cells. PD-L1 expression on the target cells significantly decreased cytokine release of CAR T cells, although the T cells’ co-inhibitory checkpoint profile was not altered. Inclusion of the PD-1_CD28 fusion receptor did not impair the killing capacity of the CAR and induced no unspecific CD19-independent activation. The killing capacity of CAR T cells with and without fusion receptor showed no significant differences. However, in presence of PD-L1, CAR T cells with fusion receptor could outcompete conventional first and second generation CAR T cells in terms of cytokine release. Further in vivo analyses will be performed to validate these findings. CAR T cells with PD-1_CD28 fusion receptor could be a useful tool to improve CAR T-cell functionality for treatment of advanced pediatric leukemia.

Abstract

Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste Krebserkrankung bei Kindern. Heutzutage können 80 bis 90% der erkrankten Kinder mit Hilfe von Chemotherapie und Stammzelltransplantation geheilt werden. Die Prognose für primär refraktäre oder mehrfach rezidivierende ALL ist jedoch weiterhin schlecht. Einen vielversprechenden Therapieansatz bei fortgeschrittener B-ALL stellt die Infusion von gegen CD19 gerichteten T-Zellen mit chimärem Antigenrezeptor (CAR) dar. In klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass bis zu 90% der größtenteils schwer vorbehandelten Patienten nach CAR-T-Zell-Gabe eine komplette Remission erlangen. Trotz dieser zeitweiligen Remission erleidet jedoch etwa die Hälfte der Patienten, die mit einem konventionellen anti-CD19 CAR behandelt werden, ein Rezidiv der Grunderkrankung. Eine weitere Erforschung und Optimierung des Therapieansatzes mit CAR-T-Zellen ist somit notwendig. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe legen nahe, dass ko-inhibitorische Immuncheckpointmoleküle auf der Oberfläche von Leukämiezellen eine erfolgreiche T-Zell-Antwort beeinträchtigen können. Daraufhin entwickelten wir CAR-T-Zellen mit einem zusätzlichen PD-1_CD28 Checkpointfusionsrezeptor. Dieser Rezeptor besteht aus einer inhibitorischen extrazellulären PD-1 und einer stimulatorischen intrazellulären CD28 Domäne. Dadurch kann ein ursprünglich inhibitorisches Signal der Leukämiezelle vermittelt über die PD-1/PD-L1-Achse in ein CD28 vermitteltes stimulatorisches Signal für die T-Zelle umgewandelt werden. In diesem Projekt konnten wir CAR-T-Zellen der ersten und zweiten Generation mit und ohne PD-1_CD28 Fusionsrezeptor mittels retroviraler Transduktion erfolgreich herstellen. Die CAR-T-Zellen besaßen eine gute Expansionsfähigkeit, eine hohe Viabilität und den vorteilhaften Phänotyp einer zentralen Gedächtnis- oder Effektor-Gedächtnis-T-Zelle. Die Funktionalitätstests zeigten ein starkes Aktivierungs-, Killing-, und Proliferations-Vermögen der anti-CD19-CAR-T-Zellen nach Erkennung der Zielzellen. Übereinstimmend mit bisherigen Veröffentlichungen setzten Zweit-Generationen-CAR-T-Zellen verglichen zu Erst-Generationen-CAR-T-Zellen höhere Zytokinmengen frei, obwohl das ko-inhibitorische Checkpointprofil der T-Zellen gleich war. Der Fusionsrezeptor beeinträchtigte die Killing-Rate der CAR-T-Zellen nicht und vermittelte keine unspezifische, CD19-unabhängige Aktivierung. Das Killing-Vermögen der CAR-T-Zellen mit und ohne Fusionsrezeptor zeigte keine signifikanten Unterschiede. Gemessen an der Zytokinausschüttung waren die CAR-T-Zellen mit Fusionsrezeptor in Anwesenheit von PD-L1 den konventionellen Erst- und Zweit-Generationen-CAR-T-Zellen überlegen. Weitere Versuche werden in vivo durchgeführt, um diese Ergebnisse validieren zu können. CAR-T-Zellen mit PD-1_CD28 Fusionsrezeptor könnten ein vielversprechendes Verfahren sein, um die CAR-T-Zell-Funktionalität bei Behandlung von fortgeschrittener pädiatrischen Leukämie in einem Patienten-individualisierten Rahmen zu verbessern.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: CAR T cells, Fusion Receptor
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 7. Dezember 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Feuchtinger, Tobias