Induction of T-cell attack against ALL through a TIM-3-CD28 fusion receptor

Ortner, Eva (2023): Induction of T-cell attack against ALL through a TIM-3-CD28 fusion receptor. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

CAR T-cell therapy is a promising new option for treatment of relapsed or refractory pediatric ALL, yet durable remissions remain unachievable for many patients. Relapse after CAR T-cell therapy has been associated with intrinsic dysfunctionality and exhaustion of CAR T cells. Although the cause of CAR T-cell malfunction remain poorly understood, an involvement of co-inhibitory checkpoints appears likely. With this in mind, this study aims at characterizing the role of co-inhibitory molecule TIM-3 in CAR T cells and provides strategies to overcome CAR T-cell dysfunctionality. First, we determined the effect of TIM-3 on CAR T cells using an overexpression model. CAR T cells with TIM-3 overexpression showed diminished viability and expansion rates after retroviral transduction and displayed a tendency towards a more differentiated phenotype compared to conventional CAR T cells. Notably, both first and second generation CAR T cells with TIM-3 overexpression demonstrated impaired functionality against CD19-positive target cells, yet this effect was not further amplified through addition of the TIM-3 ligand CEACAM. Interestingly, cytotoxicity was not influenced by TIM-3 overexpression, but presence of CEACAM markedly decreased killing in CAR T cells, regardless of TIM-3 overexpression. To circumvent TIM-3 mediated inhibition of CAR T cells, we generated TIM-3/CD28 fusion receptors incorporating differentially designed intracellular, transmembrane, and extracellular domains and first evaluated their functionality in primary T cells. The synthetic fusion protein would transform TIM-3 mediated inhibition into CD28 mediated T-cell activation. Fusion receptor transduced T cells outperformed untransduced T cells in terms of cytokine secretion and proliferation. Interestingly, activation potential of fusion receptor-transduced T cells correlated with CD28 proportion in the construct and was highest for constructs 28-TM2 and 28-TM3. Based on these results, we chose these constructs for further characterization in a first and second generation CAR T-cell setting. First generation CAR T cells were able to outperform conventional CAR T cells in terms of activation, cytotoxicity, cytokine secretion, and proliferation after co-culture with CEACAM-positive target cells. Yet, second generation CAR T cells with a fusion receptor were only superior in proliferation and activation but showed no advantages over conventional CAR T cells in cytokine secretion and cytotoxicity. Despite the high functionality of CAR T cells with fusion receptor upon target-cell contact, their phenotype was comparable to that of conventional CAR T cells. Collectively, this study shows that TIM-3 expression is associated with impaired CAR T-cell response in vitro, but implementation of a TIM 3/CD28 fusion receptor can restore functionality. Thus, our results provide a framework for further in vivo characterization of TIM-3/CD28 fusion receptors and their successful transfer into CAR T-cell therapy.

Abstract

Die CAR-T-Zell Therapie ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung der fortgeschrittenen pädiatrischen ALL. Trotz anfangs gutem Therapieansprechen erleidet ein Großteil der Patienten nach wenigen Monaten ein Rezidiv, welches durch einen Funktionsverlust der CAR-T-Zellen entstehen kann. Obwohl die genauen Ursachen eines Funktionsverlusts weitestgehend unbekannt sind, ist eine Involvierung von ko inhibitorischen Immuncheckpoints denkbar. Unsere Arbeit greift dieses Thema auf und beschäftigt sich mit der Frage, welche Rolle der ko-inhibitorische Checkpoint TIM-3 auf CAR-T-Zellen ausübt und bietet Strategien für eine Verbesserung der CAR-T-Zell Antwort. Die Rolle von TIM-3 auf CAR-T-Zellen wurde mithilfe eines Überexpressions Modells untersucht. CAR-T-Zellen mit TIM-3 Überexpression zeigten eine reduzierte Expansion und Viabilität, sowie einen tendenziell ausdifferenzierteren Phänotyp als konventionelle CAR-T-Zellen. Sowohl Erst- als auch Zweitgenerations-CAR-T-Zellen mit TIM-3-Überexpression waren weniger funktionell gegen Leukämiezelllinien hinsichtlich Zytokinsekretion, Proliferation und Aktivierung, zeigten aber keinen signifikanten Unterschied in der Zytotoxizität. Die Hinzunahme des TIM-3 Liganden CEACAM hatte keine Auswirkungen auf die Funktionalität mit Ausnahme der Zytotoxizität, da alle CAR T Zellen unabhängig von TIM 3 Überexpression verminderte Zytotoxizität gegen CEACAM-positive Leukämiezellen zeigten. Angesichts der starken Inhibition durch TIM-3 entwarfen wir TIM-3/CD28 Fusionsrezeptoren mit unterschiedlich aufgebauten intra-, trans-, und extrazellulären Membrandomänen, um sie hinsichtlich ihrer Funktionalität zunächst in T Zellen zu untersuchen. Das Prinzip der Fusionsrezeptoren basiert auf der Umwandlung des TIM-3-vermittelten, inhibitorischen Signals in ein aktivierendes Signal über die intrazelluläre CD28-Domäne. Es zeigte sich, dass die Funktionalität der Fusionsrezeptoren mit dem CD28-Anteil im Konstrukt korrelierte und die Konstrukte 28-TM2 und 28-TM3 dementsprechend die höchste Aktivierbarkeit aufwiesen. Daher charakterisierten wir diese Fusionsrezeptoren anschließend in Erst und Zweitgenerations CAR-T-Zellen hinsichtlich ihrer Funktionalität gegen CEACAM-positive Leukämiezellen. CAR-T-Zellen mit Fusionsrezeptor waren konventionellen Erstgenerations-CAR-T-Zellen funktionell überlegen, wiesen jedoch keinen Vorteil gegenüber konventionellen Zweitgenerations CAR-T-Zellen auf. Trotz ihrer hohen Funktionalität zeigten die CAR-T-Zellen mit Fusionsrezeptor keine stärkere Ausdifferenzierung des Phänotyps nach Kontakt mit Leukämiezellen. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass TIM-3 einen inhibitorischen Effekt auf die Funktionalität von CAR-T-Zellen ausübt, diese jedoch durch den Einbau eines TIM-3/CD28 Fusionsrezeptors wiederhergestellt und sogar verbessert werden kann. Damit bildet diese Arbeit die Grundlage für eine weitere in vivo Charakterisierung des TIM-3/CD28 Fusionsrezeptors und somit dessen erfolgreiche Integration in die CAR-T-Zell Therapie.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 19. Januar 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Feuchtinger, Tobias