Identification of circulation-derived exosomal microRNA candidates for liquid biopsy in pediatric acute lymphoblastic leukemia

Bartholomé, Robert (2022): Identification of circulation-derived exosomal microRNA candidates for liquid biopsy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

MicroRNA aus Exosomen -extrazellulären Vesikeln, die auch physiologisch ubiquitär der Zell-Zell-Kommunikation dienen- wurde in vielen Neoplasien als wichtiger Bestandteil der Kommunikation von soliden Tumoren mit ihrer Ni-sche identifiziert. Auch in akuten Leukämien gibt es einige wenige Studien zu dieser Interaktion, aber besonders die Korrelation von exosomaler Beeinflus-sung und klinischen Verläufen bleibt bislang unbeleuchtet. Da Exosomen in die Blutbahn freigesetzt werden, können Informationen über diese Kommuni-kation mit einer peripheren Blutabnahme gewonnen werden, einer „liquid bi-opsy“. In dieser Arbeit wurde die exosomale microRNA-Expression aus peripheren Blutproben von Patienten mit pädiatrischer akuter lymphoblastischer Leukämie analysiert und mit ihren klinischen Verläufen korreliert, um potenzielle „liquid biopsy“-Marker zu identifizieren, schwere Verläufe vorherzusagen und zu ver-hindern. Dazu wurden 179 verschiedene microRNAs mit dem „Qiagen miRCURY Focus panel“ in 11 Plasmaproben von Patienten sowie von 3 gesunden Kon-trollpersonen analysiert. Beim Vergleich der Proben von therapierefraktären zu therapieansprechenden Patienten, die zum Zeitpunkt der Diagnosestellung und vor Therapiebeginn abgenommen wurden, zeigten die exosomale mir-23b-3p-, mir-409-3p- und mir-7-5p-Expressionen die signifikantesten Unterschiede: Eine Hochregulati-on von exosomaler mir-23b-3p (p=0.006) und mir-409-3p (p=0.005) und eine Herunterregulation von exosomaler mir-7-5p (p=0.003) in den therapierefraktä-ren Proben. Diese exosomalen microRNA-Expressionsunterschiede sind vielversprechen-de Kandidaten für eine „liquid biopsy“, um schon bei der Diagnosestellung Patienten zu identifizieren, die von einer vorzeitigen Therapieeskalation profi-tieren könnten. Im Vergleich von Patientenproben gegen gesunde Kontrollproben waren die exosomale mir-484 (p=0.0002), mir-92a-3p (p=0.0004) und mir-25-3p (p=0.0009) am signifikantesten hochreguliert. Um zu beweisen, dass diese Exosomen direkt von den Leukämiezellen stam-men, und nicht von anderen „bystander“-Zellen, wurde im Rahmen dieser Ar-beit eine neuartige Methode etabliert, in der Exosomen aus dem Serum von „patient derived xenograft“- Mäusen mit akuter Leukämie mit einem anti-CD63-Immunpräzipitationsverfahren humanspezifisch extrahiert wurden. Diese Me-thode zur Bestimmung der Speziesspezifität und somit der „cell of origin“ der Exosomen, zeigte hohe Sensitivität und konnte humane Exosomen bis zur Verdünnung 1:100 von humanem Serum zu Mausserum detektieren. Mit der Methode konnte gezeigt werden, dass die signifikanten Expressionsun-terschiede von exosomaler mir-484, mir-92a-3p und mir-25-3p im Blut von Pati-enten gegenüber Gesunden direkt durch das Aussenden aus Leukämiezellen bedingt ist. Diese Identifikation der Leukämiezellen als Ursprung ermöglicht weiterführende Studien zur funktionellen Analyse der exosomalen microRNA-Expressionen und weiterhin Studien zur Identifikation von therapeutischen Zielen gegen die von der Leukämie ausgehenden exosomal-vermittelten Ni-schenreprogrammierung.

Abstract

MicroRNA derived from exosomes -extracellular vesicles involved in physiolog-ical cell-to-cell communication- has been identified as a key component in tu-mor-to-niche-communication in various solid neoplasias. There is limited data about this communication for acute leukemias, especially the correlation be-tween exosomal reprogramming and the patients’ clinical course remains to be investigated. Because exosomes are released in the bloodstream, information about this communication is available via a peripheral venipuncture, a “liquid biopsy”. We analyzed the exosomal microRNA expression from patients suffering from pediatric acute lymphoblastic leukemia and correlated them to the clinical course to identify potential liquid biopsy markers to indicate and prevent ad-verse courses. Therefore, 179 microRNAs were analyzed with the Qiagen miRCURY qPCR Focus panel in 11 patients’ plasma samples and 3 samples from healthy indi-viduals. When comparing therapy refractory to therapy responding patient samples taken at the timepoint of initial diagnosis prior to therapy, exosomal mir-23b-3p, mir-409-3p and mir-7-5p expression showed the most significant difference with an upregulation of exosomal mir-23b-3p (p=0.006) and mir-409-3p (p=0.005) and a downregulation of mir-7-5p (p=0.003) in the refractory sam-ples. These exosomal microRNA expression differences represent promising candi-dates for a liquid biopsy to prevent therapy refraction by escalation of therapy a priori. Exosomal mir-484 (p=0.0002), mir-92a-3p (p=0.0004) and mir-25-3p (p=0.0009) were most significantly upregulated in patients’ samples compared to healthy controls. To prove that these exosomes originate directly from the leukemia cells and not from other “bystander” cells, we established a novel assay using a patient de-rived xenotransplant (PDX) mouse model. Therefore, we extracted exosomes from PDX mice with acute leukemia human specifically via an anti-CD63 im-munocapture. This assay to identify species specific exosomes and therefore the cells of origin of these exosomes revealed high sensitivity, detecting hu-man:mouse serum titrations down to a ratio of 1:100. With our assay, we confirmed that the significant expression differences of ex-osomal mir-484, mir-92a-3p and mir-25-3p in patients’ blood compared to healthy individuals are directly caused by the leukemia cells. By identifying the leukemia cells as cells of origin, we here lay the groundwork to allow a func-tional analysis of these exosomal microRNAs and the identification of possible therapeutic targets against leukemia-derived exosome-mediated niche repro-gramming.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: ALL, exosomes, microRNA, liquid biopsy, PDX
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 30. November 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Jeremias, Irmela