In vitro Evaluation von Adipose tissue-derived stem cells und dezellularisiertem porcinem Nasenseptumknorpel zur Regeneration des Nasenseptumknorpels

Kuhlmann, Constanze (2022): In vitro Evaluation von Adipose tissue-derived stem cells und dezellularisiertem porcinem Nasenseptumknorpel zur Regeneration des Nasenseptumknorpels. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Der Verlust des Nasenseptumknorpels (NSK) stellt die plastisch-rekonstruktive Rhinochirurgie vor große Herausforderungen. Die Rekonstruktion erfordert die autologe Transplantation von Ohr- oder Rippenknorpel, diese ist jedoch mit mechanischen und kosmetischen Komplikationen assoziiert. Ein künstlich hergestelltes Knorpelersatzmaterial, das die biologischen und biomechanischen Anforderungen erfüllt, könnte eine potentielle therapeutische Alternative darstellen. Xenogene dezellularisierte Extrazellulärmatrix (EZM)-Verbindungen haben sich in vorherigen Studien als mögliche Alterantiven für Tissue Engineering Applikationen qualifiziert. In Verbindung mit humanen Chondrozyten als Zellquelle, zeigte das Material großes regeneratives Potential. Allerdings ist die Verwendung von Chondrozyten durch die geringe Verfügbarkeit und schwere Zugänglichkeit limitiert. Adipose tissue-derived Stem Cells (ASCs) sind adulte Stammzellen, die aus Fettgewebe isoliert werden können. Aufgrund dessen stehen sie in großen Mengen zur Verfügung und qualifizieren sich durch ihre Stammzelleigenschaften als alternative Zellquelle für den artifiziellen Knorpelersatz mit dezellularisiertem porcinem Nasenseptumknorpel (dpNSK). Ziel dieser Arbeit war es dpNSK mit ASCs zu besiedeln und die Zell-Matrix Interaktionen im Hinblick auf die Eignung als Knorpelersatzmaterial zu evaluieren. Dafür wurden zuerst ASCs aus humanem Fettgewebe isoliert und die Stammzelleigenschaften (Multipotenz und klonogenes Potential) demonstriert, sowie die typischen Oberflächenmarker (CD29, CD105, CD44, CD13, CD90, CD45, CD235a und CD31) in der Durchflusszytometrie analysiert. Anschließend wurden ASCs auf dpNSK-Stanzbiopsien ausgesät und mit einem kommerziell erhältlichem Nährmedium chondrogen induziert. Parallel dazu wurde eine Kontrollgruppe unter identischen Bedingungen in Standardkulturmedium kultiviert. Der Begriff „Interaktion“ wurde auf die Zelladhäsion, -distribution, -vitalität, -proliferation, -invasion und -differenzierung festgelegt und mit biochemischen Assays (alamarBlue, PicoGreen, DMMB) und histologischen Färbungen (Live-Dead, DAPI/ Phalloidin, Alcian Blau/ Kernechtrot) evaluiert. Da dpNSK als EZM-Verbindung die histologische Organisation von humanem NSK aufweist, konnten innerhalb des Scaffolds verschiedene Zonen identifiziert werden, die sich durch die 3D-Struktur und Zusammensetzung der EZM-Inhaltsstoffe unterscheiden. Ausgehend von den verschiedenen Phänotypen der Chondrozyten im nativen Knorpel konnten drei Zonen identifiziert werden: Die superfizielle Proliferationszone, die intermediäre Transitzone und die zentrale Hypertrophiezone. Um den Einfluss der EZM-Zone auf das Stammzellschicksal zu untersuchen wurden in einem weiteren Teil dieser Arbeit ASCs direkt auf der superfiziellen oder zentralen Zone von dpNSK kultiviert und chondrogen induziert. Anschließend wurden die Zelleigenschaften auf den beiden Zonen anhand der oben aufgeführten Methoden und auf der Ebene der Genexpression mittels qPCR untersucht und verglichen. Im Experiment konnte dpNSK als ein geeignetes Habitat für ASCs identifiziert werden, das die metabolische Aktivität der Stammzellen unterstützt und Zellteilung ermöglicht. Unter der Stimulation mit chondrogenen Wachstumsfaktoren wurde zudem eine signifikante chondrogene Differenzierung innerhalb des Scaffolds beobachtet. Die ASCs zeigten somit vergleichbare Eigenschaften auf dpNSK wie humane nasale Chondrozyten in vorherigen Studien und stellen eine alternative Zellquelle, oder einen möglichen Partner für eine Co-Kultur für die zellbasierte Knorpelregeneration des NSK dar. Allerdings ist eine Erhöhung der Matrixporosität notwendig, um die Zellinvasion in tiefere Schichten des Scaffolds zu verbessern und eine Durchwanderung zu erreichen. Bei der direkten Besiedlung der verschiedenen dpNSK-Zonen konnte eine höhere Proliferation und die Elevation früher Chondrogenese- und Faserknorpelmarker (COL1A, COL2A1, ITGA10, ITGA11) bei ASCs auf der superfiziellen Zone beobachtet werden. ASCs, die auf der zentralen Zone kultiviert wurden, zeichneten sich durch eine statistisch signifikant höhere GAG-Produktion und die Hochregulierung von Hypertrophiemarkern (MMP13, COLX) aus. Zudem konnte durch die direkte Besiedlung der zentralen Zone die Zellinvasion deutlich verbessert werden. Die verschiedenen EZM-Zonen modulierten somit die Stammzellaktivität von ASCs auf dpNSK und die Zellen adaptierten einige zonen-spezifische Zellmerkmale von nativen Chondrozyten. Die Erkenntnis, dass das Schicksal der ASCs durch die zonale 3D-Architektur und die Zusammensetzung der EZM-Makromoleküle des Scaffolds in unterschiedliche Richtungen beeinflusst werden kann, ist von hoher Relevanz für weitere Tissue Engineering Applikationen, insbesondere für moderne 3D-Druckverfahren. Weitere Studien sind notwendig, um die ausschlaggebenden Faktoren in der Matrixorganisation zu identifizieren, um so langfristig gesehen den Herstellungsprozess eines biomimetischen und histologisch-organisierten Knorpelersatzmaterials zu optimieren.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Tissue Engineering, Nasenseptumknorpel, Xenograft, Adipose tissue-derived Stem Cells
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 17. November 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Schenck, Thilo