Podoptose- eine bisher unbekannte Ursache für akutes Nierenversagen

Fleckinger, Kristina (2022): Podoptose- eine bisher unbekannte Ursache für akutes Nierenversagen. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Es ist bekannt, dass murine-double-minute-2 (MDM2) einen protektiven Effekt auf die Homöostase und somit das Langzeitüberleben von Podozyten hat, indem es vor Podoptose (p53-overactivation-cell-death) schützt. Allerdings ist wenig über die Rolle von MDM2 in Tubulusepithelzellen (TECs) bekannt. Um die Bedeutung von MDM2 in murinen Nieren zu erforschen, habe ich TEC-spezifische Pax8rtTA-Cre;Mdm2flox/flox Mäuse (Mdm2 KO) mit Doxycyclin bis zu 17 Tagen behandelt. Die erfolgreiche TEC-spezifische Mdm2 Deletion und die damit verbundene Überexpression von p53 konnte mittels real-time PCR und immunhistologischer Färbungen bestätigt werden. Der Verlust von MDM2 in TECs führte zu einem akuten Nierenversagen, welches mit einer Erhöhung der mRNA Expressionwerte bekannter Tubulusschädigungmarker, wie KIM-1 und L-Fabp, einer Abnahme der glomerulären Filtrationsrate sowie einer Zunahme der Serumharnstoffmenge assoziiert war. Histologisch konnte man Veränderungen in der Zellpolarität, vermehrt Tubulusdilatation und Auffälligkeiten innerhalb der Lumina der Tubuli feststellen. Die Elektronenmikroskopie zeigte Veränderungen in Form von einer Vakuolenbildung. Um die Relevanz der Interaktion von MDM2 und des Transkriptionsfaktor p53 in diesem Kontext zu untersuchen, habe ich einen TEC-spezifischen Doppelknockout von MDM2 und p53 (Mdm2/p53 dKO) generiert. Die Deletion von p53 führte zu einer signifikanten Verminderung der Schädigungsmarker KIM-1 und L-Fabp, Tubulusnekrose, Casts, Tubulusdilatation und eine verbesserte Nierenfunktion und Überlebensrate im Vergleich zu Mdm2 KO Mäusen mit vorhandenem p53 Wildtypallel. D.h., dass die Deletion von p53 in Mdm2/p53 dKO Mäusen vor akutem Nierenversagen schützt. Eine Lectinfärbung der Nierenschnitte von Mdm2 KO Mäusen zeigte, dass überwiegend proximale und nicht distale TECs im Rahmen des akuten Nierenversagens betroffen sind. Um die Zelltodform der proximalen TECs zu identifzieren, habe ich TECs mit verschiedenen Zelltodinhibitoren (Z-VAD, Necrostatin-1, Dabrafenib, Cyclosporin A und Ferrostatin) in vitro kultiviert. Dabei verbesserte sich signifikant die Zellviabilität der TECs bei Einsatz der Inhibitoren von RIPK1, RIPK3 sowie der mitochondrialen Permibilitäts-Transitions-Pore (Necrostatin-1, Dabrafenib und Cyclosporin-A), aber nicht bei dem Apoptoseinhibitor Z-VAD. Allerdings führte die in vivo Behandlung der Mdm2 KO Mäuse mit Z-VAD und Necrostatin-1 nicht zu einer verbesserten Nierenfunktion im Vergleich zu DMSO-behandelten Tieren. Wohingegen Dabrafenib zu einer signifikant verbesserten Nierenfunktion beitrug, obwohl histologisch eine veränderte Zellmorphologie der TECs sowie verstopfte Tubuluslumina zu beobachtet waren. Aufgrund der verbesserten Nierenfunktion der Mdm2 KO Mäuse nach Dabrafenib Behandlung, generierte ich eine Mauslinie mit selektivem Ripk3 Knockout in TECs (Pax8rtTA-Cre;Ripk3 KO), um mehr über die Rolle von RIPK3 während des akuten Nierenversagens herauszufinden. Wie zu erwarten, zeigten Pax8rtTA-Cre;Ripk3 KO Mäuse eine verbesserte Nierenfunktion und weniger Tubulusschaden im Vergleich zu Mdm2 KO Tieren. Schlussfolgernd kann ich sagen, dass erstens MDM2 für das Überleben und die Homöostase der TECs und somit der Nierenfunktion essentiell ist. Zudem führt die p53 Überexpression zu vermehrter Podoptose, wobei ich davon ausgehe, dass u.a. das Molekül RIPK3 eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion spielt. Weiterführende Untersuchungen sind notwendig, um eine Interaktion von RIPK3 und Podoptose zu bestätigen.

Abstract

Murine-double-minute-2 (MDM2) is known for its protective effects in homeostasis and consequently for the survival of podocytes in preventing podoptosis (p53-overactivation-cell-death). However, research on the role of MDM2 in tubular epithelial cells (TECs) is limited. In order to investigate the effects of MDM2 in murine kidneys, I treated TEC-specific Pax8rtTA-Cre;Mdm2flox/flox mice (Mdm2 KO) with doxycycline for up to 17 days. The successful TEC specific loss of MDM2 and consequently the overexpression of p53 has been confirmed by real-time PCR and immunohistological staining. Deficiency of MDM2 in TECs contributed to acute kidney injury and failure, which was associated with an increase in the mRNA expression levels of well-known tubular injury markers such as KIM-1 und L-Fabp, a decline in the glomerular filtration rate (GFR) and an elevation of serum urea. In addition, I observed histological abnormalities including changes in cell polarity, augmented tubular dilatation and transformation within the tubular lumen as well as abnormal vacuoles by electron microscopy. To further investigate the interaction between MDM2 and the transcriptional factor p53, I generated TEC specific MDM2 and p53 double knockout mice (Mdm2/p53 dKO). Deletion of both MDM2 and p53 prevented mice from tubular injury as indicated by reduced mRNA expression levels of KIM-1 und L-Fabp, less tubular necrosis, casts and tubular dilatation, and ameliorated kidney function as compared with Mdm2 KO mice with an existing p53 wild type allele. Mdm2/p53 dKO mice also had a higher survival rate indicating that the deletion of p53 in Mdm2/p53 dKO mice protects from acute kidney injury and failure. Lectin staining of kidney sections from Mdm2 KO mice showed that proximal but not distal TECs were predominantly affected. In order to identify the form of cell death in proximal TECs, I cultured TECs in the presence or absence of different cell death inhibitors including Z-VAD, necrostatin-1, dabrafenib, cyclosporin A und ferrostatin in vitro. Treating TECs with necrostatin-1 (RIPK1 inhibitor), dabrafenib (RIPK3 inhibitor) and cyclosporin-A (mitochondrial permeability transition pore inhibitor) significantly improved the viability of TECs, while the apoptosis inhibitor Z-VAD had no effect. However, blocking RIPK1 and apoptosis with necrostatin-1 and Z-VAD, respectively, in vivo did not prevent Mdm2 KO mice from kidney injury as compared with DMSO-treated mice (control). Interestingly, dabrafenib treatment improved kidney function in Mdm2 KO mice, although I observed morphological changes in TECs and clogged tubular lumen. Due to the improved kidney function in these mice after dabrafenib treatment, I generated another mouse line with a selective knockout of RIPK3 in TECs (Pax8rtTA-Cre;Ripk3 KO) to investigate the role of RIPK3 during acute kidney injury and failure. As expected, Pax8rtTA-Cre;Ripk3 KO mice showed reduced tubular injury and an improved kidney function as compared with Mdm2 KO animals. In conclusion, the data of this thesis indicate that MDM2 is essential for the homeostasis of TECs and therefore for maintaining kidney function. Moreover, overexpression of p53 leads to increased podoptosis in TECs, wherein RIPK3 plays an important role in signal transduction. Further investigations are needed to unravel the interaction between RIPK3 and podoptosis.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Nierenversagen, Podoptose, p53, Mdm2
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 6. Oktober 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Anders, Hans-Joachim