Mechanismen von glomerulärem Zelltod, Entzündung und Fibrose bei der Adriamycin-induzierten Glomerulosklerose in der Maus

Krappe, Julia (2022): Mechanismen von glomerulärem Zelltod, Entzündung und Fibrose bei der Adriamycin-induzierten Glomerulosklerose in der Maus. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Die Anzahl an Patienten mit chronischen Nierenerkrankungen nimmt stetig zu und damit die gesundheitliche und ökonomische Relevanz. Die fokal segmentale Glomerulosklerose (FSGS) stellt eine häufige glomeruläre Ursache einer chronischen Nierenerkrankung dar. Sie ist durch histologische Veränderungen des Glomerulus gekennzeichnet, zu denen eine progrediente Vernarbung, entzündliche Veränderungen und der Verlust von podozytären Fußfortsätzen zählen. Dadurch kommt es zu einer Beeinträchtigung der glomerulären Filtrationsbarriere und zu fortschreitender Proteinurie im nephrotischen Bereich, was in späten Stadien zu einer terminalen Niereninsuffizienz führt. Hinsichtlich der Entstehung der FSGS gibt es unterschiedliche Erklärungsansätze, die zum einen einen podozytären Schaden durch genetische Veränderungen in kritischen podozytären Genen und durch bislang nicht definierte zirkulierende Mediatoren am Beginn der Erkrankungskaskade sehen, zum anderen die Aktivität weiterer glomerulärer Zellen wie Mesangialzellen, glomerulärer Endothelzellen und Parietalzellen beinhalten. Ein möglicher zirkulierender Mediator ist das Zytokin Tumornekrosefaktor (TNF), welches renal proinflammatorisch und proapoptisch wirkt. Zur besseren Charakterisierung der molekularen und zellbiologischen Mechanismen der FSGS wurden in der vorliegenden Arbeit die vier glomerulären Zelltypen in Einzelzellkulturen mit Adriamycin (ADR) stimuliert, das im Mausmodell ein histopathologisches Bild induziert, welches mit der humanen FSGS vergleichbar ist. Mittels Proliferations-Assay wurde der Anteil vitaler Zellen nach Stimulation mit ADR gemessen. Zusätzlich wurde durch Hinzugabe von Zelltod-Inhibitoren der Anteil ablaufender Apoptose und Nekroptose am ADR-induzierten Zelltod charakterisiert. Es zeigte sich, dass vor allem in Mesangialzellen und glomerulären Endothelzellen, in geringem Maße auch in Parietalzellen durch ADR Zelltod induziert wird. Ein Teil des ADR-induzierten Zelltodes in Mesangialzellen und glomerulären Endothelzellen lässt sich der Apoptose zuschreiben, ein weiterer Teil der Nekroptose. Korrelierend hierzu wurde auf mRNA-Ebene die Expression von den an der Nekroptose-Kaskade beteiligten Mediatoren RIPK1, RIPK3 und MLKL in Mesangialzellen und glomerulären Endothelzellen nach ADR-Exposition induziert. Zusätzlich konnte ein Teil des in glomerulären Endothelzellen ablaufenden ADR-induzierten Zelltodes durch TNF-Blockade inhibiert werden, was auf einen TNF-vermittelten Anteil des ADR-induzierten Zelltods in diesen Zellen hinweist. Podozyten dagegen blieben durch ADR-Stimulation in ihrer Vitalität unbeeinflusst. Weiter wurde in dieser Arbeit untersucht, in welchen glomerulären Zellen ADR die Expression und Sekretion des proinflammatorischen Zytokins TNF und der proinflammatorischen Chemokine CCL2 und CCL5 induziert, die zurückliegend als Mediatoren der ADR-induzierten Glomerulosklerose beschrieben wurden. Die Expression wurde auf mRNA-Ebene mithilfe quantitativer Real-Time PCR untersucht. Zur Bestimmung der Sekretion der einzelnen Mediatoren wurden Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) -Untersuchungen verwendet. Nach ADR-Exposition wurde in Mesangialzellen die Expression und Sekretion von TNF und CCL2 induziert. Auch glomeruläre Endothelzellen zeigten eine vermehrte Expression und Sekretion von CCL2. Sowohl Podozyten als auch Parietalzellen exprimierten diese proinflammatorischen Marker nach ADR-Exposition nicht. Eine CCL5-Sekretion konnte nicht durch ADR, jedoch durch TNF in allen vier glomerulären Zelltypen induziert werden. Schließlich wurden Mechanismen der glomerulären Vernarbung durch die Expressionsanalyse von profibrotischen Markern (Pro-Kollagen 1 und 4, Fibronektin, Laminin) in den vier glomerulären Zelltypen nach ADR-Exposition untersucht. Auch hier fand sich besonders in Mesangialzellen eine deutlich gesteigerte Expression dieser Marker. In glomerulären Endothelzellen wurde besonders Fibronektin und Laminin auf mRNA-Ebene induziert, während Parietalzellen und Podozyten vermehrt Laminin exprimierten. In Mesangialzellen wurden nach ADR-Stimulation bei vergleichbarer Expression der Matrixmetalloproteinasen MMP2 und MMP9 deren Inhibitoren TIMP-1 und -2 vermehrt exprimiert. In Podozyten und Parietalzellen wurde durch TNF dagegen die Expression von MMP9 induziert. Zusammenfassend zeigen die erarbeiteten Daten, dass ADR besonders auf Mesangialzellen und glomeruläre Endothelzellen eine direkt zytotoxische Wirkung hat und unter anderem Formen des regulierten Zelltods wie Apoptose und Nekroptose induziert. Zudem löst ADR-Exposition die Expression und Sekretion proinflammatorischer Zyto- und Chemokine wie TNF und CCL2 aus. Diese wiederum können parakrin möglicherweise eine sekundäre Schädigung der Podozyten durch vermehrte glomeruläre Inflammation hervorrufen. Schließlich scheint ADR vor allem in exponierten Mesangialzellen und glomerulären Endothelzellen direkt eine vermehrte Expression extrazellulärer Matrixmoleküle zu induzieren. Somit könnten die Inhibition ADR-induzierter Zelltodformen, die Produktionshemmung proinflammatorischer Zyto- und Chemokine oder die Blockierung extrazellulärer Matrixbildung besonders in Mesangialzellen und glomerulären Endothelzellen mögliche therapeutische Strategien in der Behandlung der FSGS darstellen.

Abstract

The number of patients suffering from chronic kidney disease (CKD) continues to rise. Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) is a common glomerular cause for CKD. Its histopathological features include a focal and segmental sclerosis of the glomerulus, a progressive glomerular inflammation and the loss of podocyte foot processes. This podocyte injury leads to leakage of the glomerular filtration barrier, resulting in nephrotic range proteinuria and subsequently end-stage kidney disease. Podocyte damage might be caused by genetic alterations in critical podocyte genes, yet unknown circulating permeability factors and inflammatory mediators like the cytokine tumor necrosis factor (TNF) cytokine. The involvement of other glomerular cells in the pathophysiology of FSGS, such as mesangial cells, glomerular endothelial cells and parietal cells, is increasingly recognized. To further characterize molecular and cellular mechanisms that lead to FSGS, the current experiments focused on adriamycin (ADR)-induced responses in cultured glomerular cells. ADR-nephropathy is a well-established experimental model of FSGS in rodents with similar histopathological changes as seen in human FSGS. To determine the number of vital cells after exposure to ADR, a proliferation assay was used. ADR induced cell death particularly in mesangial cells and glomerular endothelial cells, and to a lesser extent in parietal endothelial cells. To further characterize the type of cell death, inhibitors of apoptosis and necroptosis were added. It was shown that ADR induced both apoptosis and necroptosis in mesangial cells and glomerular endothelial cells. This was paralleled by increased mRNA expression of the necroptosis-associated mediators RIPK1, RIPK3 and MLKL in these cells. ADR-induced cell death in glomerular endothelial cells was partly TNF-dependent, as it could be reduced by TNF-blockade. ADR exposure did not induce significant cell death in cultured podocytes. ADR-induced expression of proinflammatory mediators like TNF and the inflammatory chemokines CCL2 and CCL5 was analyzed by real-time PCR and enzyme-linked immunosorbent assays were used. ADR led to increased expression and secretion of TNF and CCL2 in mesangial cells, and increased expression and secretion of CCL2 in glomerular endothelial cells. Furthermore, TNF induced CCL5-secretion in all four glomerular cell types in vitro. Following exposure to ADR, mesangial cells expressed profibrotic markers such as pro-collagen 1 and 4, fibronectin and laminin. Glomerular endothelial cells induced expression of fibronectin and laminin, and podocytes and parietal endothelial cells showed an increased expression of laminin upon stimulation with ADR. In summary, these results demonstrate a direct cytotoxic effect of ADR on mesangial and glomerular endothelial cells as well as the induced secretion of proinflammatory cytokines and chemokines following ADR exposure in these cells. This might lead to secondary podocyte damage via paracrine cross-talk between glomerular cells. Moreover, ADR exposure directly induced the expression of extracellular matrix molecules, particularly in mesangial and glomerular endothelial cells. Thus, targeting cell death as well as the production of proinflammatory mediators and extracellular matrix molecules, specifically in mesangial and glomerular endothelial cells, emerge as potential therapeutic strategies of FSGS in the future.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Fokal segmentale Glomerulosklerose, Adriamycin
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 13. Oktober 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Vielhauer, Volker