PD-L1 enhanced cisplatin resistance in non-small cell lung cancer through PI3K/AKT/mTOR

Xu, Yinhui (2022): PD-L1 enhanced cisplatin resistance in non-small cell lung cancer through PI3K/AKT/mTOR. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Objective: Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a disease with high morbidity and mortality. Cisplatin (DDP) is one of the most widely used chemotherapy regimens. However, patients who take cisplatin-based drugs for a long time are prone to develop side effects such as ototoxicity, nephrotoxicity and drug resistance, and these side effects seriously affect patients' quality of life and treatment outcomes. The current findings suggest that chemotherapeutics can suppress tumor immune responses and achieve tumor immune escape by remodeling immune cells and altering PD-L1 expression in tumor cells. Therefore, it is of clinical concern whether cisplatin may limit the anti-tumor effect of the organism by inducing immunosuppression in lung cancer or not. Studies on the effects of cisplatin on PD-L1 expression in NSCLC cell lines are scarce, and the intracellular regulatory mechanisms are unclear. Our study focused on unraveling the effects and on clarifying whether the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway (PATSP) also played a regulatory role in this process. We also compared the difference in PD-L1 expression between NSCLC cisplatin-resistant cell lines (NSCLC/DDP) and NSCLC naïve cell lines. This study aimed to reveal that NSCLC/DDP cell lines contribute to tumor immune escape. This phenomenon might be caused by the high expression of PD-L1 regulated by PATSP. Our research also provided new evidence that low concentrations of cisplatin promote tumor immune evasion in NSCLC cell lines. Providing a new direction for better immunotherapy in cisplatin-resistant patients is the clinical significance of this study. Methods: We successfully induced A549/DDP cells that were not available in the laboratory by incrementing the concentration method. Therefore, A549, HCC827, H1975 cell lines, and A549/DDP, HCC827/DDP, H1975/DDP cell lines were selected for this research. Cisplatin, XL-765 (dual PI3K/mTOR inhibitor), and 740Y-P (PI3K agonist) were selected as stimulating drugs. We first detected the IC50s and EC50s of the above six cell lines stimulated by the above drugs with CCK-8 kit and determined the optimal concentration range of the drugs. After that, we detected the invasion capability, migration capability, proliferation rate and apoptosis rate of the cell lines after drug stimulation by Transwell, Wound healing, CellTiter-Glo ® 2.0 and Flow cytometry assays. These experiments were able to show the variations in cellular function after stimulation of NSCLC cell lines with cisplatin, XL-765 and 740Y-P. In the following experiments, we initially detected the expression differences of PD-L1 in the above cells before and after drug stimulation by Immunohistochemistry and then the differences in expression of PD-L1, p-AKT (phosphorylated AKT), AKT, p-S6 (phosphorylated S6) and S6 proteins were then detected by Western blot. Finally, we also compared PD-L1 mRNA and membrane PD-L1 expression differences in the cell lines before and after drug stimulation by qRT-PCR and Flow cytometry. Results: There are five primary outcomes that we can learn. 1. The cell activity, invasion capability, and migration capability of NSCLC/DDP cell lines were higher than those of the corresponding NSCLC naïve cell lines, but the apoptosis rates of NSCLC/DDP cell lines were lower than that of the corresponding NSCLC naïve cell lines. Cisplatin and 740Y-P both had a promoting effect on the cellular function of NSCLC naïve cell lines, while XL-765 had an inhibitory effect. 2. Low concentrations of cisplatin significantly up-regulated the expression of cell membrane PD-L1 and total PD-L1 in NSCLC naïve cell lines, and the expression levels tended to increase with increasing concentrations of cisplatin.3. PD-L1 expression was significantly higher in NSCLC/DDP cells than in NSCLC naïve cells but was significantly reduced after stimulation with XL-765. 4.In H1975 and H1975/DDP cell lines, a low concentration of cisplatin and 740Y-P could increase the expression of p-AKT, AKT, p-S6, S6, and PD-L1, while XL-765 could decrease the expression. 5. The degree of increase and decrease in the expression of p-AKT, AKT, p-S6, S6, and PD-L1 correlated with the drugs' treatment time and treatment concentration. Conclusion: Our results suggested that low concentrations of cisplatin could promote PD-L1 expression in NSCLC cells, leading to cisplatin resistance and immune escape in NSCLC cell lines. The over-activated PATSP was involved in cisplatin-induced up-regulation of PD-L1 expression. Inhibition of this signaling pathway resulted in decreased expression of PD-L1 and, to some extent, reversed immune escape caused by cisplatin resistance in NSCLC cell lines.

Abstract

Zielsetzung: Nichtkleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) ist eine Krankheit mit hoher Morbidität und Mortalität. Cisplatin (DDP) ist eines der am häufigsten eingesetzten Chemotherapieschemata. Patienten, die Cisplatin-haltige Medikamente über einen langen Zeitraum einnehmen, neigen jedoch dazu, Nebenwirkungen wie Ototoxizität, Nephrotoxizität und Arzneimittelresistenz zu entwickeln, und diese Nebenwirkungen beeinträchtigen die Lebensqualität der Patienten und die Behandlungsergebnisse erheblich. Die aktuellen Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Chemotherapeutika die Immunreaktion von Tumoren unterdrücken und durch den Umbau von Immunzellen und die Veränderung der PD-L1-Expression in Tumorzellen eine Flucht des Tumorimmunsystems ermöglichen können. Daher ist es von klinischem Interesse, ob Cisplatin die Anti-Tumor-Wirkung des Organismus durch Induktion von Immunsuppression bei Lungenkrebs einschränken kann oder nicht. Es gibt nur wenige Studien über die Auswirkungen von Cisplatin auf die PD-L1-Expression in NSCLC-Zelllinien, und die intrazellulären Regulationsmechanismen sind unklar. Unsere Studie konzentrierte sich darauf, die Auswirkungen zu entschlüsseln und zu klären, ob der PI3K/Akt/mTOR-Signalweg (PATSP) bei diesem Prozess ebenfalls eine regulatorische Rolle spielt. Außerdem verglichen wir den Unterschied in der PD-L1-Expression zwischen cisplatinresistenten NSCLC-Zelllinien (NSCLC/DDP) und naiven NSCLC-Zelllinien. Ziel dieser Studie war es, zu zeigen, dass NSCLC/DDP-Zelllinien zur Immunflucht des Tumors beitragen. Dieses Phänomen könnte auf die hohe Expression von PD-L1 zurückzuführen sein, die durch PATSP reguliert wird. Unsere Forschung lieferte auch neue Beweise dafür, dass niedrige Konzentrationen von Cisplatin die Umgehung des Tumorimmunsystems in NSCLC-Zelllinien fördern. Die klinische Bedeutung dieser Studie liegt darin, dass sie eine neue Richtung für eine bessere Immuntherapie bei cisplatinresistenten Patienten aufzeigt. Methoden: Wir haben erfolgreich A549/DDP-Zellen induziert, die im Labor nicht verfügbar waren, indem wir die Konzentrationsmethode erhöht haben. Daher wurden die Zelllinien A549, HCC827, H1975 und A549/DDP, HCC827/DDP, H1975/DDP für diese Untersuchung ausgewählt. Cisplatin, XL-765 (dualer PI3K/mTOR-Inhibitor) und 740Y-P (PI3K-Agonist) wurden als stimulierende Medikamente ausgewählt. Zunächst wurden die IC50- und EC50-Werte der oben genannten sechs Zelllinien, die durch die oben genannten Medikamente stimuliert wurden, mit dem CCK-8-Kit ermittelt und der optimale Konzentrationsbereich der Medikamente bestimmt. Danach haben wir die Invasionsfähigkeit, die Migrationsfähigkeit, die Proliferationsrate und die Apoptoserate der Zelllinien nach Medikamentenstimulation durch Transwell-, Wundheilungs-, CellTiter-Glo ® 2.0- und Durchflusszytometrie-Assays ermittelt. Diese Experimente konnten die Veränderungen der Zellfunktionen nach Stimulation der NSCLC-Zelllinien mit Cisplatin, XL-765 und 740Y-P aufzeigen. In den folgenden Experimenten wiesen wir zunächst die Unterschiede in der Expression von PD-L1 in den oben genannten Zellen vor und nach der Medikamentenstimulation durch Immunhistochemie nach. Anschließend wurden die Unterschiede in der Expression von PD-L1, p-AKT (phosphoryliertes AKT), AKT, p-S6 (phosphoryliertes S6) und S6-Proteinen durch Western Blotting nachgewiesen. Schließlich verglichen wir auch die Unterschiede in der PD-L1-mRNA- und Membran-PD-L1-Expression in den Zelllinien vor und nach der Medikamentenstimulation mittels qRT-PCR und Durchflusszytometrie. Ergebnisse: Es gibt fünf Hauptergebnisse, die wir lernen können. 1. Die Zellaktivität, Invasionsfähigkeit und Migrationsfähigkeit der NSCLC/DDP-Zelllinien waren höher als die der entsprechenden naiven NSCLC-Zelllinien, aber die Apoptoseraten der NSCLC/DDP-Zelllinien waren niedriger als die der entsprechenden naiven NSCLC-Zelllinien. Cisplatin und 740Y-P hatten beide eine fördernde Wirkung auf die zelluläre Funktion der naiven NSCLC-Zelllinien, während XL-765 eine hemmende Wirkung hatte. 2. Niedrige Konzentrationen von Cisplatin führten zu einer signifikanten Hochregulierung der Expression von PD-L1 an der Zellmembran und des Gesamt-PD-L1 in naiven NSCLC-Zelllinien, und die Expressionsniveaus tendierten dazu, mit steigenden Konzentrationen von Cisplatin zuzunehmen.3. die PD-L1-Expression war in NSCLC/DDP-Zellen signifikant höher als in naiven NSCLC-Zellen, wurde aber nach Stimulation mit XL-765 signifikant reduziert. In den Zelllinien H1975 und H1975/DDP konnte eine niedrige Konzentration von Cisplatin und 740Y-P die Expression von p-AKT, AKT, p-S6, S6 und PD-L1 erhöhen, während XL-765 die Expression verringern konnte. 5. Der Grad der Zunahme und Abnahme der Expression von p-AKT, AKT, p-S6, S6 und PD-L1 korrelierte mit der Behandlungszeit und der Behandlungskonzentration der Medikamente. Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass niedrige Konzentrationen von Cisplatin die Expression von PD-L1 in NSCLC-Zellen fördern können, was zu Cisplatin-Resistenz und Immun-Escape in NSCLC-Zelllinien führt. Der überaktivierte PATSP war an der Cisplatin-induzierten Hochregulierung der PD-L1-Expression beteiligt. Die Hemmung dieses Signalwegs führte zu einer verringerten PD-L1-Expression und kehrte in gewissem Maße die durch Cisplatin-Resistenz verursachte Immunflucht in NSCLC-Zelllinien um.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: PD-L1, Non-small cell lung cancer, Cisplatin,Immunotherapy, Chemotherapy, PI3K/Akt/mTOR
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 29. September 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Huber, Rudolf Maria