Analysis of the brain vasculature in a novel mouse model of HTRA1-related cerebral small vessel disease

Gerhard, Ameli Elisabeth (2022): Analysis of the brain vasculature in a novel mouse model of HTRA1-related cerebral small vessel disease. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Zerebrale Mikroangiopathien sind eine wesentliche Ursache für Schlaganfälle und vaskuläre Demenz. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen sind jedoch noch unvollständig verstanden. Daher haben sich einige monogenetische Formen als Forschungsmodelle etabliert. Hierzu gehören HTRA1-assoziierte familiäre Mikroangiopathien, die durch Funktionsverlustmutationen im HTRA1-Gen verursacht werden, welches die ausschließlich als Homotrimer aktive Serinprotease HTRA1 kodiert. Einige pathogene Mutationen, darunter R274Q, beeinträchtigen die multimere Bindung von HTRA1. Die Arbeitsgruppe von Martin Dichgans konnte experimentell HTRA1-D174R als komplementäre Korrektor-Mutante identifizieren, welche in vitro sowohl den multimeren Zustand als auch die Proteaseaktivität von HTRA1-R274Q wiederherstellt. In meiner Arbeit verwendete ich eine neuartige, die Mutation HTRA1-R274Q tragende Mauslinie. Meine Ziele waren: (i) Die Charakterisierung des zerebrovaskulären Proteoms der Htra1R274Q-Mäuse, (ii) die Erpro-bung des Rescues von HTRA1-R274Q durch HTRA-D174R in vivo mithilfe eines adenovi-ralen Vektors (AAV) und (iii) die Untersuchung potenzieller dominant-negativer Effekte der Mutation R274Q. Dazu verwendete ich schwerpunktmäßig Massenspektrometrie, Immunhistochemie, Immunoblot oder RT-qPCR an Hirnschnitten oder isolierten Hirngefä-ßen. Meine Ergebnisse zeigten reduzierte HTRA1-Proteinlevel in Htra1R274Q- im Vergleich zu Htra1Wildtyp (wt)-Mäusen. Weiterhin konnte ich in Htra1R274Q-Hirngefäßen eine deutliche Anreicherung von Extrazellulärmatrixproteinen, v.a. FN, LTBP4, FBLN5 und EGFL8 nachweisen. Diese Proteine sind bekannte HTRA1-Substrate. Zusätzlich sind FN, LTBP4 und FBLN5 etablierte Faktoren der Elastogenese, was darauf hindeutet, dass HTRA1-Funktionsverlust ebendiese beeinflusst. Darüber hinaus etablierte ich ein Protokoll, das die selektive Analyse unterschiedlicher Hirngefäßfraktionen (große und kleine leptomeningeale vs. parenchymale Gefäße) erlaubt. Anhand dieses Protokolls zeigte ich, dass die in Htra1R274Q-Hirngefäßen angereicherten Proteine vor allem in leptomeningealen Htra1wt-Gefäßen exprimiert werden und in Htra1R274Q-Gefäßen ebendort akkumulieren. Trotz effektiver Transduktion parenchymaler Gefäße führte eine Infektion mit AAV-HTRA1-D174R nicht zu einer Linderung des molekularen Phänotyps der Htra1R274Q-Hirngefäße. Dies ist dadurch erklärbar, dass sich die molekularen Veränderungen vor allem in leptomeningealen Htra1R274Q-Gefäßen finden, die – wie ich feststellen konnte – nicht durch das verwendete AAV transduziert werden. Zuletzt untersuchte ich anhand der Htra1R274Q-Mauslinie potenzielle dominant-negative Effekte der Mutation R274Q. Um zu evaluieren, ob das R274Q-Allel mit dem wt-Allel interferiert, verglich ich die Hirngefäße von Htra1wt/R274Q- und haploinsuffizienten Htra1+/--Mäusen. In Htra1wt/R274Q-Hirngefäßen konnte ich keine verstärkte FN- und LTBP4-Akkumulation feststellen, was eher gegen dominant-negative Eigenschaften der Mutation R274Q sprich. Meine Ergebnisse tragen zum Verständnis der Pathophysiologie HTRA1-assoziierter familiärer Mikroangiopathien bei. Insbesondere konnte ich in leptomeningealen Htra1R274Q-Hirngefäßen eine Dysregulation von in die Elastogenese involvierten Extrazellulärmatrixproteinen aufzeigen. Zukünftige Studien könnten darauf aufbauend die multimere Anordnung oder Stabilität von HTRA1 und damit potenzielle Therapieoptionen zum Ziel haben.

Abstract

Cerebral small vessel disease (cSVD) is a significant cause of stroke and vascular dementia, while the underlying pathomechanisms are poorly understood. Several monogenic forms have emerged as instrumental models to examine the pathophysiology of cSVD. Among these, HTRA1-related familial cSVDs are linked to loss-of-function mutations in the HTRA1 gene encoding the secreted homotrimeric serine protease HTRA1. A subset of pathogenic mutations, including R274Q, impair the multimeric assembly of HTRA1. The laboratory of Martin Dichgans experimentally identified HTRA1-D174R as a complementary corrector mutation able to restore both multimeric state and protease function of HTRA1-R274Q in vitro. Using a novel mouse line bearing the HTRA1-R274Q mutation, the aims of my work were to (i) characterize the cerebrovascular proteome of Htra1R274Q mice, (ii) explore the rescue of HTRA1-R274Q by HTRA1-D174R in vivo using an adeno-viral vector (AAV), and (iii) investigate putative dominant-negative effects of mutation R274Q. For this purpose, I mainly applied mass spectrometry, immunohistochemistry, immunoblot, or RT-qPCR to mouse brain sections or to isolated mouse brain vessels. First, I detected a marked reduction of HTRA1 protein levels in Htra1R274Q compared to Htra1wildtype (wt) animals. Second, I highlighted a distinct accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins, especially fibronectin (FN), LTBP4, FBLN5, and EGFL8, in Htra1R274Q brain vessels. Second, I highlighted a distinct accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins, especially fibronectin (FN), LTBP4, FBLN5, and EGFL8, in Htra1R274Q brain vessels. These proteins are all documented HTRA1 substrates. Notably, FN, LTBP4, and FBLN5 are well-described elastogenic factors, suggesting that HTRA1 loss-of-function interferes with elastogenesis. Moreover, I established a novel vessel isolation protocol that allows the proteomic analysis of distinct brain vessel fractions (large and small leptomeningeal vessels vs. parenchymal vessels). Using this protocol, I found that the proteins enriched in Htra1R274Q vessels are primarily expressed in leptomeningeal Htra1wt vessels, and that the leptomeningeal vasculature is their predominant site of accumulation in Htra1R274Q vessels. Infection with AAV-HTRA1-D174R did not alleviate the molecular phenotype of Htra1R274Q brain vessels despite efficient and long-term transduction of parenchymal capillaries. This can be explained by the fact that the primary site of mo-lecular alterations in Htra1R274Q brain vessels are leptomeningeal arteries and arterioles, which I found not to be targeted by the used AAV. Furthermore, I took advantage of the Htra1R274Q mouse line to examine putative dominant-negative effects of mutation R274Q. Specifically, I compared brain vessels from Htra1wt/R274Q and haploinsufficient Htra1+/- mice to evaluate whether the R274Q allele interferes with the function of the wt allele. I found no exacerbation of FN and LTBP4 accumulation in Htra1wt/R274Q brain vessels, speaking rather against dominant-negative properties of mutation R274Q. Collectively, my observations provide new insights into the mechanisms underlying HTRA1-related cSVD. In particular, my results highlight a deregulation of ECM proteins involved in elastogenesis in the leptomeningeal vasculature of Htra1R274Q mice. My work further opens perspectives for future intervention targeting HTRA1 multimeric assembly or stability and potential therapeutic applications.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 29. September 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Dichgans, Martin