Phänotypischer Switch der vaskulären glatten Muskelzellen: Die Rolle von ARNO in resistinvermittelter Migration

Gräff, Pascal (2022): Phänotypischer Switch der vaskulären glatten Muskelzellen: Die Rolle von ARNO in resistinvermittelter Migration. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind statistisch gesehen die weltweit führende Todesursache. In der westlichen Welt verbreitete Erkrankungen wie das metabolische Syndrom und der damit verbundene Diabetes Mellitus Typ II (DM II), werden in Zusammenhang mit einem erhöhten Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung gesetzt. Ein zentraler pathologischer Prozess, der durch die kardiovaskulären Erkrankungen gefördert wird, ist die Atherosklerose. Verschiedene Faktoren, wie zum Beispiel der phänotypische Switch der vaskulären glatten Muskelzellen (VGMZ), tragen zur Plaquebildung in eben diesen bei. Der phänotypische Switch, genauer gesagt die Dedifferenzierung der VGMZ, wurde als sehr wichtig für das Fortschreiten der Atherosklerose identifiziert. Unter normalen Bedingungen sind VGMZ ausdifferenziert. In diesem Zustand haben sie einen kontraktilen Phänotyp und reihen sich an der Außenseite des Gefäßendothels auf. Durch Stimulation mittels Wachstumsfaktoren, inflammatorischen Zytokinen oder Adipokinen verändern diese VGMZ ihren Phänotyp von der ruhenden differenzierten zur proliferierenden und migrierenden Zelle. Dies führt zur Migration der VGMZ ins Gefäßinnere, wo sie zu proliferieren beginnen und damit zu einer Verdickung und im weiteren Verlauf zur Versteifung der vaskulären Wand in Form eines Plaques beitragen. Resistin ist ein Adipokin, welches beim Menschen primär von Immunzellen sezerniert wird und an der Entstehung von Insulinresistenz und Übergewicht beteiligt ist. Darüber hinaus konnte eine Verbindung zwischen Resistin und der gesteigerten Produktion proinflammatorischer Zytokine in Endothelzellen nachgewiesen werden, wodurch Atherosklerose und eine vaskuläre Inflammation gefördert wird. Interessanterweise wurde für Resistin ebenfalls eine induzierende Wirkung auf die VGMZ-Proliferation und -Migration, sowie eine gesteigerte Produktion von Metalloproteasen (MMP) nachgewiesen. Dies sind Faktoren, welche durch die Dedifferenzierung der VGMZ begünstigt sind. Die zugrundeliegenden Mechanismen und Signalkaskaden in resistinaktivierten VGMZ sind dabei bisher noch nicht vollständig erforscht. ARF nucleotide-binding site opener (ARNO) ist ein Guaninnukleotid Austauschfaktor, (GEF) der in der Lage ist, kleine GTPasen, wie zum Beispiel ARF6 und Rac, zu aktivieren. Dadurch ist ARNO in der Migrationssteigerung von Epithelzellen und Präadipozyten beteiligt. Bisher war jedoch nicht bekannt, ob ARNO eine Rolle in der Dedifferenzierung der VGMZ spielt. Darüber hinaus ist nicht bekannt, inwieweit ARNO an der Migration, Adhäsion und MMP-Produktion in VGMZ beteiligt ist. Ebenso wurde das therapeutische Potential einer ARNO-Inhibition noch nicht untersucht, obwohl diverse Entdeckungen eine wichtige Rolle von ARNO in der pathologischen Migration und Gewebeinvasion in VGMZ vermuten lassen. Aus diesem Grund zielt diese Arbeit auf die Untersuchung, ob ARNO eine resistininduzierte VGMZ Proliferation, -Adhäsion, -Migration und MMP-2 Expression in vitro beeinflusst, ab. Darüber hinaus wurden die zugrundeliegenden Signalkaskaden, welche hieran beteiligt sind, erforscht. Pathologische Konzentrationen von Resistin (100 ng/ml) hatten, gemessen anhand eines MTT-Assays, keinen Einfluss auf die Proliferation von porcinen VGMZ. Eine signifikante Steigerung der Adhäsion (p<0,05; n=18) und der Migration, gemessen durch einen Wundheilungs-Assay (p<0,05; n=5), sowie die MMP-2 mRNA Expression (p<0,05; n=6) konnte aber beobachtet werden. Die pharmakologische Inhibition von ARNO durch Secin H3 (15µM) reduzierte die VGMZ-Adhäsion (p<0,05; n=18), Migration (p<0,05; n=11) und MMP-2 Expression (p<0,05; n=11) signifikant. Darüber hinaus verhinderte die Expression von inaktivem ARNO (ARNO E156K), durch pDNA-Transfektion, ebenfalls signifikant die resistininduzierte VGMZ-Migration und MMP-2 Expression (p<0,05; n=3) im Vergleich zu jenen Zellen mit ARNO Wildtyp (WT) Expression (p<0,05; n=10). Eine Hemmung der PI3K (LY294002; 10 µM) (p<0,05; n=4), AKT (AKT-Inhibitor; 10µM) (p<0,05; n=4) und p38 MAPK (SB203580; 10 µM) (p<0,05; n=4) beeinträchtigte ebenso die VGMZ-Migration. Die Inhibition der p38 MAPK reduzierte ebenfalls die resistininduzierte MMP-2 Expression (p<0,05; n=10). Interessanterweise reduzierte die Expression von ARNO E156K die resistinabhängige AKT und p38 MAPK Aktivierung (p<0,06; n=6 und n=7), aber nicht die Aktivierung von ERK1/2 MAPK (n=4) verglichen mit ARNO WT und untersucht durch Detektion der aktivierenden Phosphorylierungen mittels Western Blot. Zuletzt wurde die Bedeutung der PI3K für die ARNO-Funktion in VGMZ durch die Expression einer ARNO Mutante (ARNO R280D) mit einer Mutation in der PH-Domäne, welche die Bindung an die PIP3 verhindert, untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die VGMZ-Migration unter Resistin-Stimulation (p<0,05; n=5) und MMP-2 Expression (p<0,05; n=10) hierdurch verhindert wurde, indem die Aktivierung von AKT (p<0,05; n= 6) und der p38 MAPK (p<0,05; n=7) ausblieb. Diese Ergebnisse zeigen erstmalig, dass hohe Resistin-Konzentrationen einen pathologischen Effekt auf VGMZ ausüben, indem sie die Migration und MMP-2 Expression induzieren. Ebenso konnte gezeigt werden, dass der GEF ARNO eine wichtige Rolle in der resistinvermittelten Induktion der VGMZ Adhäsion, Migration und MMP-2 Expression zukommt. Als dritte große Erkenntnis konnte nachgewiesen werden, dass ARNO als intermediäres zentrales Protein Resistin mit dem AKT und dem p38 MAPK Signalweg verbindet. Dies lässt den Schluss zu, dass die resistininduzierte Funktion von ARNO stark den phänotypischen Switch der VGMZ induziert. Dies sollte als potenzielles therapeutisches Ziel der kardiovaskulären Erkrankung weiter untersucht werden.

Abstract

Cardiovascular disease is the leading cause of death worldwide and common diseases of the western world, such as diabetes type 2 (DM II) and the metabolic syndrome, are associated with higher risk for developing cardiovascular disease. A prominent pathologic process contributing to cardiovascular disease is atherosclerosis. Several factors, such as inflammatory cytokines, inflammatory cell activation, lipid sequestration and phenotypic switching of vascular smooth muscle cells (VSMC), contribute to the formation of plaques in vessels. The phenotypic switch or dedifferentiation of VSMC have been shown to be critical for atherosclerosis progression. Under normal conditions, VSMC are differentiated thus exhibiting a contractile phenotype and line the outside of the vessels. Upon stimulation with growth factors, inflammatory cytokines or adipokines, these VSMC change their phenotype from a quiescent differentiated one to a proliferative and migratory dedifferentiated one. Thus, VSMC migrate from the vessel towards the intima where they then proliferate and contribute to a thickening and stiffening of the vascular wall (vascular plaque). Resistin is an adipokine secreted mainly from immune cells and is involved in the development of insulin resistance and obesity. Moreover, resistin has been shown to increase pro-inflammatory cytokine production in endothelial cells thereby promoting vascular inflammation and atherosclerosis. Interestingly, resistin was repeatedly shown to induce VSMC proliferation, migration as well as the production of metalloproteinases (MMP), supporting the dedifferentiated phenotype of VSMC. However, the underlying mechanisms or signaling intermediates in resistin induced VSMC activation have not been fully investigated. ARNO (ARF nucleotide-binding site opener) is a guanine nucleotide exchange factor (GEF), thus activating small GTPases, such as ARF6 and Rac. In this way ARNO has been shown to drive migration of epithelial cells and preadipocytes. However, so far, it is not known, if ARNO additionally has a part in the pathological dedifferentiation of VSMC. Specifically, the impact of ARNO for VSMC migration, adhesion and MMP production has not yet been investigated. Moreover, the therapeutic potential of an inhibition of ARNO activity for the process of pathological VSMC tissue invasion has not yet been explored. Thus, this study aimed to investigate if ARNO influences resistin induced VSMC proliferation, adhesion, migration and MMP-2 expression in vitro. Furthermore, the underlying involved signalling pathways were investigated. Pathological concentrations of resistin (100ng/ml) failed to induce proliferation of porcine aortic VSMC (n=14), as assessed by MTT-assay, but significantly promoted both VSMC adhesion (p<0.05, n=18) and migration, measured by a wound healing assay, (p<0.05, n=5) as well as MMP-2 mRNA expression (p<0.05, n=6). Pharmacological inhibition of ARNO by Secin H3 (15 µM) reduced resistin induced VSMC adhesion (p<0.05, n=18), migration (p<0.05, n=11) and MMP-2 expression (p<0.05, n=11). Moreover, expression of an inactive ARNO (ARNO E156K), by pDNA transfection, significantly prevented resistin induced VSMC migration and MMP-2 expression (p<0,05; n=3) compared to expression of wildtype ARNO (ARNO WT) (p<0.05, n=10). The signalling pathways PI3K/AKT and p38 MAPK were shown to be responsible for resistin induced VSMC migration, as inhibition of these using the PI3K inhibitor LY294002 (10µM) (p<0.05, n=4), AKT-inhibitor (10µM) (p<0.05, n=4) and p38 MAPK inhibitor SB203580 (10µM) (p<0.05, n=4) impaired the VSMC migration into a scratch in the cell layer. Inhibition of the p38 MAPK was also shown to reduce the resistin induced MMP-2 expression (p<0.05, n=10). Interestingly, expression of ARNO E156K reduced the resistin dependent activation of AKT and p38 MAPK (p<0,05, n=6 and p<0,05, n=7, respectively) but not ERK1/2 MAPK (n=4) compared to ARNO WT, as assessed by detection of their phosphorylation by western blot. Finally, PI3K was shown to be important for ARNO function in VSMC, as expression of ARNO with a mutation in the PH-domain (ARNO R280D) and no longer able to bind to PIP3, was observed to impair VSMC migration (p<0.05, n=5) and MMP-2 expression (p<0.05, n=10) via an inability to induce activation of AKT (p<0.05, n=6) and p38 MAPK (p<0.05, n=7). The results obtained here firstly confirm high concentrations of resistin to be pathological to VSMC by inducing migration and MMP-2 expression. Secondly, the obtained data show that the GEF ARNO plays an important role in promoting VSMC adhesion, migration and MMP-2 expression upon resistin activation. Thirdly, ARNO was shown to be a pivotal intermediate signalling protein linking resistin activation to activation of the AKT and p38 MAPK signalling pathways. In conclusion, resistin induced ARNO function strongly influences the phenotypic switch of VSMC and should be further investigated as a potential therapeutic target for cardiovascular disease.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 29. September 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Mannell, Hanna