A novel perspective on the in vivo chromatin landscape of Saccharomyces cerevisiae

Verhagen, Daan George Frederik (2022): A novel perspective on the in vivo chromatin landscape of Saccharomyces cerevisiae. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Chromatin is the defining feature of the eukaryotic genome and is essential for survival. The basic units of chromatin are abundantly present and are referred to as nucleosomes. These nucleosomes are often described and visualized as ‘beads on a string’. However, unlike beads on a string, nucleosomes are not randomly scattered across the chromatin, but are generally well positioned in a stereotypical pattern. This pattern is characterized by a nucleosome free region (NFR), followed by a regular pattern – or array – of nucleosomes which are typically phased relative to a defined genomic location. The organization of nucleosomes allows for controlled gene expression and is therefore regarded as a key regulatory element. A major influence on the position of nucleosomes are ATP dependent chromatin remodelers. These remodelers may work synergistically or antagonistically and often take redundant roles in positioning nucleosomes throughout the chromatin landscape. Mutations or deletions of these remodelers can lead to genome instability, loss of array regularity or diminished phasing, thus increasing heterogeneity in the chromatin landscape. Besides remodelers, other minor factors such as the inherent DNA sequence and general regulatory factors (GRFs) influence the chromatin landscape. Moreover, the chromatin landscape across independent (healthy) cells and genomic locations may be altered or vary significantly as a result of the cell cycle stage or genome replication. Due to the plethora of different factors that can be of influence, it is difficult to dissect how the chromatin landscape is shaped. In this thesis, we investigate generation and heterogeneity of the chromatin landscape in S. cerevisiae. To this end, we initially developed a novel sequencing approach that allows us to probe the location of nucleosomes on a single chromatin fiber. We show that this approach provides several unique insights allowing us to determine cell-to-cell heterogeneity and which factors attribute to array regularity. Moreover, we provide a detailed description of experiment procedures and analyses that result in optimal reproducibility, accuracy and throughput. We applied our novel approach to initially investigate the rDNA loci in vivo and utilized our high throughput and accuracy to scrutinize previous observations on these loci. Our results find a similar dichotomy in the chromatin landscape, but do not agree with the transcriptionally independent character proposed previously. As our approach could uniquely detect the heterogeneity of individual chromatin fibers, we investigated the underlying regularity of arrays that would otherwise be classified as irregular using traditional techniques. We find that despite a lack of phasing, nearly all arrays display a high regularity in wild type cells. Similarly, previous findings suggested that lack of ISWI and CHD remodelers would result in unphased arrays, but could not definitively provide evidence for a lack of regularity. Here, we show direct evidence that deletion of these remodelers results in unphased and irregular nucleosomal arrays. We further investigate in vitro findings suggesting a ‘clamping’ model in which remodeler activity results in a density independent array spacing. Comparison of computational modeling with our in vivo findings do not support this model. In support of previous findings by our lab, we identify that INO80 is a bona fide spacing remodeler. We further provide preliminary evidence that this novel approach can be used to detect strain variants in order to sensitively detect global changes in nucleosome occupancy. In the final chapter of this thesis, we investigate the spacing mechanism of the ISWI remodeler utilizing our sequencing approach in combination with an in vitro chromatin array. Previous findings in our lab have demonstrated the ability to investigate the kinetics of the remodeler using this array in combination with a restriction based assay. However, these results do not provide details on the remodeling process and how nucleosomes are moved on a single fiber. To this end, we first designed a novel DNA template containing multiple Widom 601 sequences and linkers optimized for our sequencing approach. These optimizations would allow for accurate determination of nucleosome positions before and during remodeling. Our findings suggest that these arrays can be efficiently chromatinized by salt gradient dialysis (SGD) and that remodeling can be performed as previously described. In our preliminary findings we validate that the optimizations to the DNA template have a potential to improve accuracy in determining the nucleosome position. Taken together, in this thesis I document the technological advancements and novel, previously unobtainable, insights that characterize the S. cerevisiae chromatin landscape. Furthermore, these findings lay the foundation for future studies to apply an analogous approach on more complex, multicellular organisms and identify how chromatin regulates life.

Abstract

Eukaryotische Zellen verpacken und schützen ihre Erbinformationen mit Hilfe von Chromatin. Chromatin ist für diese Zellen überlebenswichtig. Nukleosome sind die Grundbausteine des Chromatins. Sie sind entlang der DNA wie Perlen auf einer Schnur positioniert. Die Nukleosome sind jedoch nicht etwa zufällig entlang des Genoms verstreut. In der Nähe der Startstelle für die Transkription befindet sich im Allgemeinen eine nukleosomenfreie Region (NFR). Diese wird gefolgt von vielen Nukleosomen, die in sehr regelmäßigen Abständen angeordnet sind. Wenn man dieses sog. Nukleosomen-‚Array‘ in verschiedenen Zellen kartiert, bemerkt man, dass es sich an erstaunlich ähnlichen Stellen befindet. Man spricht in dem Zusammenhang von einem phasierten ‚Array‘. Diese stereotype Organisation von Nukleosomen ermöglicht die Kontrolle der Genexpression und wird daher als ein wichtiges regulatorisches Element angesehen. Einen großen Einfluss auf die Position von Nukleosomen haben ATP-abhängige Chromatin-‚Remodeling‘-Enzyme. Diese Enzyme können synergistisch oder antagonistisch zueinander wirken und übernehmen häufig redundante Rollen bei der Positionierung von Nukleosomen im Genom. Mutationen oder Deletionen dieser Enzyme können zu Instabilität des Genoms, zum Verlust der Regelmäßigkeit der Nukleosomen-‘Arrays‘ oder zu verminderter Phasierung führen, wodurch die Heterogenität in der Chromatinlandschaft erhöht wird. Neben ‚Remodelern‘ beeinflussen andere Faktoren wie die DNA-Sequenz und Allgemeine Regulatorische Faktoren (GRFs) die Nuklesomenlandschaft. Die Nukleosomenlandschaft kann zwischen verschiedenen Zellytpen oder in Abhängigkeit des Zellzyklus variieren. Aufgrund der Vielzahl unterschiedlicher Einflussfaktoren ist es aber schwierig, die Biogenese der Chromatinlandschaft zu analysieren. In dieser Arbeit untersuchen wir die Biogenese und Heterogenität der Chromatinlandschaft in Saccharomyces cerevisiae. Zu diesem Zweck haben wir zunächst einen neuartigen Sequenzierungsansatz entwickelt, der es uns ermöglicht, die Lage von Nukleosomen auf einer einzelnen Chromatinfaser zu untersuchen. Wir zeigen, dass dieser Ansatz einzigartige Einblicke in die Nukleosomenorganisation der DNA bietet. Er ermöglicht es uns, die Heterogenität von Zelle zu Zelle zu bestimmen. Auch können wir feststellen, welche Enzymfaktoren die Regelmäßigkeit des ‚Arrays‘ hervorrufen. Wir beschreiben detailliert die Versuchsabläufe und Analysen, die zu einer optimalen Reproduzierbarkeit, Genauigkeit und hohem Durchsatz führen. Zuerst wendeten wir unsere neuartige Technik an, um den rDNA-Locus zu untersuchen. Unsere Ergebnisse bestätigen eine zuvor beschriebene Dichotomie in der Chromatinlandschaft dieses Locus. Sie stimmen jedoch nicht mit dem vorgeschlagenen transkriptionell unabhängigen Charakter einzelner rDNA-Wiederholungseinheiten überein. Des Weiteren nutzten wir unsere Technik um die Heterogenität von Nukleosomen-‚Arrays‘ zu bestimmen. Hier fokussierten wir uns u.a. auf diejenigen Regionen im Genom, die mit traditionellen Techniken als unregelmäßig klassifiziert wurden. Wir stellten fest, dass trotz fehlender Phasierung fast alle dieser ‚Arrays‘ in Wildtypzellen eine hohe Regelmäßigkeit aufweisen. Zellen, denen ISWI- und CHD-Remodeler fehlen, besitzen hingegen ein tatsächlich unregelmäßige ‚Arrays‘, die nicht auf fehlende Phasierung zurückgeführt werden können. Des Weiteren untersuchten wir, inwiefern die Reduzierung der Nukleosomendichte die Arbeit von ‚Remodeling‘ Enzymen beeinflusst. Nach der ‚Klemmen‘ Theorien sollte eine Reduzierung der Dichte die Nukleosomenabstände nicht beeinflussen. Unsere Ergebnisse, gepaart mit Computermodellierungen, deuten aber auf einen nur schwachen Beitrag dieser molekularen ‚Klemmen‘ hin. Unsere Ergebnisse stützen hingegen frühere Ergebnisse unseres Labors, dass INO80 ein Remodeler ist, der einen regelmäßigen Abstand zwischen Nukleosomen einstellen kann. Mit Hilfe einer Variante unserer Technik können wir zwei verschiedene Hefestämme miteinander mischen und dadurch gleichzeitig analysieren. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass wir so globale Veränderungen der Nukleosomendichte höchst sensitiv detektieren können. Im letzten Kapitel dieser Arbeit untersuchen wir unter Verwendung unseres Sequenzierungsansatzes, wie ISWI-Remodeler regelmäßige Abstände zwischen Nukelsomen in vitro einstellt. Frühere Ergebnisse aus unserem Labor haben gezeigt, dass die ‚Remodeling‘ Kinetik mit einem in vitro rekonstituierten Nukleosomen-‚Array‘ in Kombination mit Restriktionsendonukleasen untersucht werden kann. Diese Ergebnisse liefern jedoch keine Details zum Remodellierungsprozess und wie Nukleosomen auf einer einzelnen Faser bewegt werden. Zu diesem Zweck entwarfen wir zunächst eine neuartige DNA-Sequenz, die mehrere Widom 601-Nukleosompositionierungssequenzen enthält, die für unseren Sequenzierungsansatz optimiert wurden. Diese Optimierungen sollen eine genauere Bestimmung der Nukleosomenpositionen vor und während des ‚Remodelings‘ ermöglichen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese ‚Arrays‘ durch Salzgradientendialyse (SGD) effizient chromatinisiert werden können und dass das ISWI diese ,Arrays’ als Substrat verwenden kann. In unseren vorläufigen Ergebnissen bestätigen wir, dass die Optimierungen der DNA Sequenz das Potenzial haben, die Genauigkeit bei der Bestimmung der Nukleosomenpositionen zu verbessern. Insgesamt dokumentiere ich in dieser Arbeit die technologischen Fortschritte und neuartigen Einsichten in die Chromatinlandschaft von S. cerevisiae. Darüber hinaus legen diese Ergebnisse die Grundlage für zukünftige Studien, um mit Varianten unserer Technik Chromatin komplexerer, mehrzelliger Organismen zu untersuchen, in der Hoffnung, besser zu verstehen, wie Chromatin das Leben der Zelle reguliert.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: yeast, genetics, saccharomyces cerevisiae, nanopore, sequencing, chromatin, nucleosome, spacing, remodelers, remodeler, ISWI, CHD1, INO80
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 3. Mai 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Becker, Peter