Regulation of transcription and stability of repetitive DNA in S. pombe

Emden, Thomas van (2022): Regulation of transcription and stability of repetitive DNA in S. pombe. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Repetitive DNA is found in all kingdoms of life and in many species makes up a substan-tial portion of the genome. Repetitive DNA has many functions, such as: regulatory roles, encoding for long non-coding RNA and it makes up structural components of chromo-some. On the other hand, repetitive DNA is unstable and thus a threat to genome stability. Therefore, repetitive DNA needs to be controlled; however, many aspects of this regula-tion remain elusive. The genome of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) has several re-petitive regions; among those are the subtelomeres and long terminal repeats (LTRs) of retrotransposons. In the first part of my thesis, I unveiled novel insights into the regula-tion of the telomere associated sequence (TAS) regions. These repetitive DNA regions are present at most chromosomal ends of S. pombe. Previous work in our research group by Dr. Marta Forn has shown that the TAS regions are marked by low nucleosome occu-pancy. I demonstrated that an ectopic TAS fragment establishes nucleosome levels that are comparable with endogenous TAS regions. Thus, the nucleosome instability is an innate property that possibly originates from the high A-T content of the TAS region. Furthermore, my results showed that shelterin, a telomere protecting protein complex, counteracts the low levels of nucleosome occupancy in the TAS regions. This is observed both at the endogenous and ectopic TAS regions, demonstrating that shelterin-dependent nucleosome stability is position-independent. Additionally, I showed that the subtelomer-ic sequences are sufficient to support recombination between subtelomeres in absence of shelterin. Such genome instability may not be desirable for normal cell growth, but pro-vides a mechanism to maintain telomere stability in the absence of shelterin. This sug-gests that the TAS regions and shelterin dynamically regulate telomere maintenance. Whereas the TAS regions are located at the subtelomeres, the LTRs are present through-out the genome. Several factors are known to contribute to the repression of LTRs but to a large extent it still is unclear if and how these factors cooperate. In the second part of my dissertation, I described how distinct regulators have different specificity towards subsets of LTRs but that redundancy also exists between the different regulatory path-ways. The inner nuclear membrane protein Lem2 is one of the known regulators of LTRs but the underlying mechanism remains unclear. Lem2 was shown to contribute to hetero-chromatin silencing and perinuclear localization of centromeres. Notably, I found that Lem2 does not regulate LTRs through heterochromatin or by tethering them to the nucle-ar periphery. Rather, I found that, at least for a subset of LTRs, Lem2 acts cooperatively with the exosome-targeting factor Red1 involved in RNA degradation. Finally, to identify novel LTR regulators, I established an LTR-specific reporter assay that allowed me to perform genome-wide genetic screens. Several factors that I identified have an undescribed function in LTRs silencing, unveiling novel potential of regulatory pathways.

Abstract

Repetitive DNA findet man in allen Lebensformen und bei vielen Arten macht sie einen wesentlichen Teil des Genoms aus. Repetitive DNA hat viele Funktionen, wie zum Bei-spiel regulatorische Aufgaben, Kodierung für lange nicht-kodierende RNAs (englisch: long non-coding RNAs, lncRNAs), und sie sind an der Ausbilung der Chromosomstruk-tur beteiligt. Andererseits ist repetitive DNA instabil und damit eine Bedrohung für die Genomstabilität. Aus diesem Grund wird repetitive DNA kontrolliert, jedoch sind viele Aspekte dieser Regulation bislang wenig verstanden. Das Genom der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) weist mehrere repeti-tive Regionen auf. Darunter fallen die Subtelomere und retrotransposale Elemente, die als LTRs (englisch: long terminal repeats, LTRs) bekannt sind. Im ersten Teil meiner Disser-tation gewann ich neue Einblicke in die Regulation der Telomer-assoziierten Sequenzre-gionen (englisch: telomere associated sequence, TAS). Diese repetitiven DNA-Regionen sind an den meisten chromosomalen Enden von S. pombe vorhanden. Frühere For-schungsergebnisse von Dr. Marta Forn in unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass die TAS-Regionen durch eine geringe Nukleosomendichte gekennzeichnet sind. Ich konnte zeigen, dass die ektopische Integration eines TAS-Fragment die Chromatinstruktur ver-ändert und Nukleosomendichte vergleichbar ist mit endogenen TAS-Regionen. Somit ist die Nukleosomeninstabilität eine intrinsische Eigenschaft, die möglicherweise auf den hohen A-T-Gehalt der TAS-Region zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigten meine Ergebnisse, dass Shelterin, ein Telomer-protektiver Proteinkomplex, der geringen Nukle-osomendichte in den TAS-Regionen entgegenwirkt. Dies wird sowohl an den endogenen als auch an den ektopischen TAS-Regionen beobachtet, was zeigt, dass die Shelterin-abhängige Nukleosomenstabilität unabhängig ist von der chromosomalen Position. Ich konnte außerdem zeigen, dass in Abwesenheit von Shelterin subtelomere DNA-Sequenzen eine Rekombination zwischen Subtelomeren fördern Diese Genom-Instabilität ist für das normales Zellwachstum vermutlich nicht von Vorteil, könnte aber als Mecha-nismus dienen, um die Telomerstabilität in Abwesenheit von Shelterin aufrechtzuerhal-ten. Dies deutet darauf hin, dass die TAS-Regionen und Shelterin zusammen die Erhal-tung der Telomere dynamisch regulieren. Im Gegensatz zu den TAS-Regionen, die sich an den Subtelomeren befinden, sind die LTRs im gesamten Genom vorhanden. Es ist bekannt, dass mehrere Faktoren zur Repres-sion von LTRs beitragen, aber es ist bislang unklar, ob und wie diese Faktoren zusam-menwirken. Im zweiten Teil meiner Dissertation konnte ich zeigen, dass bestimmte Regu-latoren eine Spezifität für unterschiedliche LTR-Untergruppen aufweisen. Gleichzeitig besteht aber auch Redundanz zwischen den verschiedenen Regulationswegen. Das innere Kernmembranprotein Lem2 ist an der Regulation von LTRs beteiligt, der zu-grunde liegende Mechanismus hierfür ist bis dato aber unbekannt. Von Lem2 ist auch bekannt, dass es der Ausbildung von Heterochormatin beteiligt ist und zur perinukleären-Lokalisierung von Centromeren beiträgt. Ich konnte jedoch zeigen, dass die Funktion von Lem2 in der Regulation von LTRs nicht durch Heterochromatin oder durch Anbinden an die Kernperipherie vermittelt wird. Des weiteren konnte ich zeigen, dass für eine Unter-gruppe von LTRs Lem2 zusammen mit dem RNA Abbaufaktor Red1 kooperiert. Um weitere LTR-Regulatoren zu identifizieren, habe ich außerdem einen LTR-spezifischen Reporter-Assay etabliert, der es mir ermöglichte, genomweite genetische Screens durchzuführen. Viele der identifizierte Faktoren haben bisher unbeschriebene Funktionen in der Repression von LTRs und stellen daher ein Potenzial für neue regulato-rische Funktionswege dar.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: S. pombe, repetitive DNA, LTR retrotransposons, subtelomere
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 20. Mai 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Ladurner, Andreas