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Einfluss simulierter Körpertemperaturänderungen auf die Signalweiterleitung und Genexpression in hypothalamischen Zellen
Einfluss simulierter Körpertemperaturänderungen auf die Signalweiterleitung und Genexpression in hypothalamischen Zellen
In the process of evolution mechanisms developed in homeothermic animals where core body temperature fluctuates in a circadian manner with lowest temperatures when the organism is resting and highest temperatures in its active phases. Consequently, all cells in the body are subject to subtle temperature changes in a 24-h rhythm. Even though these physiological body temperature changes are very well established, little is known so far whether and how they act on cellular events like receptor activation or gene expression. In this work a murine hypothalamic cell line resembling thyrotropin-releasing hormone (TRH) positive neurons of the Nucleus paraventricularis and high-precision temperature incubators were employed to investigate the effects of temperature changes of ± 1 °C on basal transcription activity of a brain and muscle ARNT-like 1 (BMAL1)-, cAMP- responsive element binding protein (CREB)-, signal transducers and activators of transcription (STAT)- and forkhead box protein O (FOXO)-dependent reporter. It was found that all promoters were sensitive to temperature changes within the physiological range (35,5 – 38,5 °C) except for the FOXO-dependent promoter, where it was necessary to simulate circadian-like temperature fluctuations to induce temperature sensitivity. Moreover, we aimed to identify temperature sensitive proteins, like trancient receptor potential (TRP) channels and cold-inducible proteins, which could act as temperature sensors and translate said temperature changes into cellular events. Inhibitors of the melastatin-related TRP subfamily were able to significantly reduce temperature- promoted differences in CREB-promoter activity. Also, temperature-sensitive cAMP-formation in response to norepinephrine, salmeterol or forskolin was shown, with higher efficacy at 36 compared to 38 °C. Increasing cytosolic cAMP levels by activation of G protein-coupled receptors (GPCRs) such as the β2-adrenergic receptor (β2-AR) is essential for a plethora of physiological processes. Herein, first data linking physiologically relevant temperature fluctuations to β2-AR- induced cAMP signaling are provided by dissecting cellular events leading to cAMP- formation and the termination of the signaling cascade. In this work a model for the fine- tuning of the β2-AR-induced intracellular cAMP-level with participation of temperature dependent cAMP-efflux and phosphodiesterase activity is suggested. Hence, a so far unappreciated role for body temperature as a modulator of a class A GPCR is presented. Based on these results, the activation of the prepro-TRH promoter in response to temperature changes was investigated. In mHypoA-2/10 cells the promoter activity was highly dependent on simulated body temperature changes on a basal level as well as after stimulation with norepinephrine. Finally, the aforementioned findings could be transferred in part to different cell lines and primary cells., In homoiothermen Lebewesen haben sich Mechanismen dahingehend entwickelt, dass die Körpertemperatur in einem circadianen Rhythmus oszilliert: In Ruhephasen ist die Temperatur verringert, während sie in Phasen gesteigerter Aktivität erhöht ist. Somit sind alle Körperzellen im Tagesverlauf kleinen Temperaturschwankungen ausgesetzt. Obwohl diese physiologischen Körpertemperaturänderungen ausgiebig untersucht wurden, liegen aktuell wenige Erkenntnisse zu möglichen Auswirkungen auf zelluläre Vorgänge, wie Rezeptoraktivierung oder Genexpression, vor. In der vorliegenden Arbeit wurden eine murine hypothalamische Zelllinie, die Thyreoliberin [engl. thyrotropin-releasing-hormone (TRH)]-positiven Zellen des Nucleus paraventricularis ähnelt, sowie Präzisionsthermoinkubatoren verwendet, um die Effekte von Temperaturänderungen von ± 1 °C auf die basale Promotoraktivität des brain and muscle ARNT-like 1 (BMAL1)-, cAMP-response element binding protein (CREB)-, signal transducers and activators of transcription (STAT)- und forkhead box protein O (FOXO)-abhängigen Reporters zu untersuchen. Die Aktivität der Promotoren war von direkten Temperaturänderungen im physiologischen Bereich (35,5 – 38,5 °C) abhängig. Eine Ausnahme stellte der FOXO-abhängige Promotor dar, welcher erst nach Simulation circadianer Temperaturwechsel moduliert wurde. Des Weiteren konnten temperatursensitive Proteine mit Signalwirkung identifiziert werden, die als Temperatursensoren agieren und zelluläre Ereignisse auslösen können. Es konnte gezeigt werden, dass transient receptor potential channel melastatin-related (TRPM)-Inhibitoren den temperaturbedingten Unterschied in der CREB-Aktivierung signifikant reduzieren. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass temperaturabhängig eine erhöhte Noradrenalin-, Salmeterol- und Forskolin-induzierte cAMP-Akkumulation mit einem erhöhten Maximaleffekt bei 36 gegenüber 38 °C eintrat. Die Aktivierung G-Protein- gekoppelter Rezeptoren (GPCR), wie dem β2-Adrenozeptor, mit einer einhergehenden Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels, ist für eine Vielzahl physiologischer Vorgänge essenziell. Zelluläre Prozesse, die zu einer cAMP-Akkumulation führen, wie die Bindung an Rezeptoren mit nachfolgender G-Proteinaktivierung, sowie Mechanismen, die zu einer Beendigung der Signalkaskade führen, wie cAMP-Efflux und Phosphodiesteraseaktivität, wurden eingehend bezüglich der Auswirkung von Temperaturänderungen untersucht. In der vorliegenden Arbeit wird ein Mechanismus der Feinabstimmung des intrazellulären cAMP-Spiegels nach Stimulierung mit Noradrenalin unter Beteiligung von temperaturabhängigem Efflux und Phosphodiesteraseaktivität vorgeschlagen. Damit kann ein bislang unterschätzter Zusammenhang zwischen der Körpertemperatur und der Aktivierung von Klasse A GPCRs hergestellt und beschrieben werden. Auf diesen Befunden basierend wurde die Aktivität des prepro-TRH-Promotors nach Temperaturänderungen untersucht. In mHypoA-2/10-Zellen war sowohl die basale Aktivität des Promotors als auch die Noradrenalin-induzierte Promotoraktivierung von physiologischen Temperaturänderungen abhängig. Schließlich konnten diese Befunde teilweise noch auf weitere Zellsysteme und primäre Zelllinien übertragen werden.
body temperature receptor signaling cAMP
Faro, Dennis
2022
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Faro, Dennis (2022): Einfluss simulierter Körpertemperaturänderungen auf die Signalweiterleitung und Genexpression in hypothalamischen Zellen. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

In the process of evolution mechanisms developed in homeothermic animals where core body temperature fluctuates in a circadian manner with lowest temperatures when the organism is resting and highest temperatures in its active phases. Consequently, all cells in the body are subject to subtle temperature changes in a 24-h rhythm. Even though these physiological body temperature changes are very well established, little is known so far whether and how they act on cellular events like receptor activation or gene expression. In this work a murine hypothalamic cell line resembling thyrotropin-releasing hormone (TRH) positive neurons of the Nucleus paraventricularis and high-precision temperature incubators were employed to investigate the effects of temperature changes of ± 1 °C on basal transcription activity of a brain and muscle ARNT-like 1 (BMAL1)-, cAMP- responsive element binding protein (CREB)-, signal transducers and activators of transcription (STAT)- and forkhead box protein O (FOXO)-dependent reporter. It was found that all promoters were sensitive to temperature changes within the physiological range (35,5 – 38,5 °C) except for the FOXO-dependent promoter, where it was necessary to simulate circadian-like temperature fluctuations to induce temperature sensitivity. Moreover, we aimed to identify temperature sensitive proteins, like trancient receptor potential (TRP) channels and cold-inducible proteins, which could act as temperature sensors and translate said temperature changes into cellular events. Inhibitors of the melastatin-related TRP subfamily were able to significantly reduce temperature- promoted differences in CREB-promoter activity. Also, temperature-sensitive cAMP-formation in response to norepinephrine, salmeterol or forskolin was shown, with higher efficacy at 36 compared to 38 °C. Increasing cytosolic cAMP levels by activation of G protein-coupled receptors (GPCRs) such as the β2-adrenergic receptor (β2-AR) is essential for a plethora of physiological processes. Herein, first data linking physiologically relevant temperature fluctuations to β2-AR- induced cAMP signaling are provided by dissecting cellular events leading to cAMP- formation and the termination of the signaling cascade. In this work a model for the fine- tuning of the β2-AR-induced intracellular cAMP-level with participation of temperature dependent cAMP-efflux and phosphodiesterase activity is suggested. Hence, a so far unappreciated role for body temperature as a modulator of a class A GPCR is presented. Based on these results, the activation of the prepro-TRH promoter in response to temperature changes was investigated. In mHypoA-2/10 cells the promoter activity was highly dependent on simulated body temperature changes on a basal level as well as after stimulation with norepinephrine. Finally, the aforementioned findings could be transferred in part to different cell lines and primary cells.

Abstract

In homoiothermen Lebewesen haben sich Mechanismen dahingehend entwickelt, dass die Körpertemperatur in einem circadianen Rhythmus oszilliert: In Ruhephasen ist die Temperatur verringert, während sie in Phasen gesteigerter Aktivität erhöht ist. Somit sind alle Körperzellen im Tagesverlauf kleinen Temperaturschwankungen ausgesetzt. Obwohl diese physiologischen Körpertemperaturänderungen ausgiebig untersucht wurden, liegen aktuell wenige Erkenntnisse zu möglichen Auswirkungen auf zelluläre Vorgänge, wie Rezeptoraktivierung oder Genexpression, vor. In der vorliegenden Arbeit wurden eine murine hypothalamische Zelllinie, die Thyreoliberin [engl. thyrotropin-releasing-hormone (TRH)]-positiven Zellen des Nucleus paraventricularis ähnelt, sowie Präzisionsthermoinkubatoren verwendet, um die Effekte von Temperaturänderungen von ± 1 °C auf die basale Promotoraktivität des brain and muscle ARNT-like 1 (BMAL1)-, cAMP-response element binding protein (CREB)-, signal transducers and activators of transcription (STAT)- und forkhead box protein O (FOXO)-abhängigen Reporters zu untersuchen. Die Aktivität der Promotoren war von direkten Temperaturänderungen im physiologischen Bereich (35,5 – 38,5 °C) abhängig. Eine Ausnahme stellte der FOXO-abhängige Promotor dar, welcher erst nach Simulation circadianer Temperaturwechsel moduliert wurde. Des Weiteren konnten temperatursensitive Proteine mit Signalwirkung identifiziert werden, die als Temperatursensoren agieren und zelluläre Ereignisse auslösen können. Es konnte gezeigt werden, dass transient receptor potential channel melastatin-related (TRPM)-Inhibitoren den temperaturbedingten Unterschied in der CREB-Aktivierung signifikant reduzieren. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass temperaturabhängig eine erhöhte Noradrenalin-, Salmeterol- und Forskolin-induzierte cAMP-Akkumulation mit einem erhöhten Maximaleffekt bei 36 gegenüber 38 °C eintrat. Die Aktivierung G-Protein- gekoppelter Rezeptoren (GPCR), wie dem β2-Adrenozeptor, mit einer einhergehenden Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels, ist für eine Vielzahl physiologischer Vorgänge essenziell. Zelluläre Prozesse, die zu einer cAMP-Akkumulation führen, wie die Bindung an Rezeptoren mit nachfolgender G-Proteinaktivierung, sowie Mechanismen, die zu einer Beendigung der Signalkaskade führen, wie cAMP-Efflux und Phosphodiesteraseaktivität, wurden eingehend bezüglich der Auswirkung von Temperaturänderungen untersucht. In der vorliegenden Arbeit wird ein Mechanismus der Feinabstimmung des intrazellulären cAMP-Spiegels nach Stimulierung mit Noradrenalin unter Beteiligung von temperaturabhängigem Efflux und Phosphodiesteraseaktivität vorgeschlagen. Damit kann ein bislang unterschätzter Zusammenhang zwischen der Körpertemperatur und der Aktivierung von Klasse A GPCRs hergestellt und beschrieben werden. Auf diesen Befunden basierend wurde die Aktivität des prepro-TRH-Promotors nach Temperaturänderungen untersucht. In mHypoA-2/10-Zellen war sowohl die basale Aktivität des Promotors als auch die Noradrenalin-induzierte Promotoraktivierung von physiologischen Temperaturänderungen abhängig. Schließlich konnten diese Befunde teilweise noch auf weitere Zellsysteme und primäre Zelllinien übertragen werden.