Searching for autoimmune B cells in atherosclerosis

Zhang, Chuankai (2022): Searching for autoimmune B cells in atherosclerosis. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disorder of arteries and the leading cause of mortality worldwide. Innate and adaptive immune responses are involved in all disease stages. It has been suggested that adaptive autoimmunity may play critical roles in the initiation and progression of atherosclerosis. However, this fundamental question remains unresolved. Indeed, whether human atherosclerosis is solely an auto-inflammatory disease, whether it is a bona fide B2-driven autoimmune disease or both is still unclear. A comprehensive answer to this question would provide unprecedented opportunities to develop next-generation therapeutic strategies to treat the root causes of atherosclerosis. Tertiary lymphoid organs (TLOs) emerge in tissues in response to non-resolving inflammation, including transplant rejection, most types of cancer, autoimmune diseases, and chronic infectious diseases. Artery TLOs (ATLOs) have also been identified in the aorta adventitia of aged apolipoprotein E-deficient (ApoE-/-) mice and in human atherosclerotic tissues: ATLOs are organized into T cell areas and B cell follicles containing follicular dendritic cells (FDCs) in activated germinal centers (GCs). These data support the notion that atherosclerosis-specific B cell responses may be organized in ATLOs, which was the key question addressed in this thesis. The method of nested polymerase chain reaction (PCR) was used to clone paired heavy and light chains of B cell receptors (BCRs) in isolated B2 cells from germinal centers (GCs) of ATLOs and secondary lymphatic organs to express them in vitro. Using immunofluorescence (IF) staining, the reactivity of the recombinant antibodies in multiple murine tissues was confirmed. Co-immunoprecipitation and mass spectrometry (coIP-MS), Western blot, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), and surface plasmon resonance analyses were used to determine antibody-cognate autoantigen binding characteristics. In translational studies, human atherosclerotic plaques were examined to test whether the potential autoantibodies reacted with their cognate antigen in the arterial wall. Histone H2b was thereby identified as the first common murine and human autoantigen. Importantly, H2b triggered autoimmunity responses in vivo, which was associated with disease severity of both murine atherosclerosis and human patients with cardiovascular diseases (CVDs). Immunization against the H2b autoantigen promoted atherosclerosis in ApoE-/- mice, which demonstrated the pro-atherogenic role of H2b autoimmunity in vivo. In conclusion, these data lead us to propose that atherosclerosis is a disease that is associated with multiple autoreactive BCRs and that murine atherosclerosis and possibly human atherosclerosis may be a bona fide autoimmune disease.

Abstract

Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung der Arterienwand und die Haupttodesursache weltweit. Angeborene und adaptive Immunreaktionen sind an der Entwicklung der Atherosklerose während aller Stadien beteiligt. Eine fundamentale ungeklärte Frage hinsichtlich der Pathogenese der Erkrankung ist, ob die klinisch relevanten Spätstadien der Atherosklerose ausschließlich durch Zellen der angeborenen Immunantwort wie Makrophagen gekennzeichnet sind oder ob autoreaktive B2 Immunzellen gegen Autoantigene der Arterienwand gebildet werden. Eine Antwort auf diese Frage ist dringlich, um zukünftige Therapiestrategien der bisher nicht kausal therapierbaren Erkrankung zu entwickeln. Tertiäre Lymphorgane (TLOs) entwickeln sich bei zahllosen autoreaktiven und autoinflammatorischen Erkrankungen wie Krebs, Autoimmunerkrankungen und chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Mitglieder unserer Arbeitsgruppe charakterisierten Atherosklerose-assoziierte TLOs (ATLOs) in Apolipoprotein E-defizienten (ApoE-/-) Mäusen und in erkrankten humanen Arterien. Fortgeschrittene Stadien dieser ATLOs sind durch separate T Zellregionen und aktivierte B Zellfollikel, die follikuläre dendritische Zellen (FDCs) enthalten, gekennzeichnet. Diese Daten deuteten an, dass autoreaktive B2 Zellimmunreaktionen in ATLOs stattfinden könnten. Die Methode der Nested Polymerase Chain Reaction wurde benutzt, um die schweren und leichten Ketten der B Zell Rezeptoren (membrangebundene Immunglobuline) in isolierten B2 Zellen aus den Keimzentren von ATLOs und von sekundären Lymphorganen zu klonieren und in vitro zu exprimieren. Die resultierenden rekombinanten monoklonalen Antikörper wurden in immunhistologischen Analysen verschiedener Organe eingesetzt, um in ApoE-/- Mäusen und erkrankten humanen Geweben deren Reaktivität zu untersuchen. Koimmunpräzipitation erkrankter muriner Arterien unter Benutzung der putativen Autoantikörper wurde benutzt, um potentielle Autoantigene erkrankter Arterien zu präzipitieren, die anschließend in massenspektrometrischen Analysen zur Identifikation der Autoantigene eingesetzt wurden. Western Blots und Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) wurden etabliert, um die Serumkonzentration der klonierten Antikörper zu bestimmen. Die sogenannte Surface Plasmon Resonance Methode wurde eingesetzt, um die Affinität der klonierten Antikörper mit Autoantigenen direkt zu bestimmen. Acht Autoantikörper wurden aus 64 Kandidaten kloniert und in vitro exprimiert. Humane Gewebe wurden benutzt, um die Kreuzreaktivität dieser Antikörper gegen humane Antigene zu bestimmen. Diese Untersuchungen führten zur Identifikation des Histonproteins H2B als ein bona fide Autoantigen der murinen und humanen Atherosklerose (der Antikörper wurde als A6 Antikörper annotiert). Andere Antikörper reagierten gegen unterschiedliche Zellen der Arterienwand einschließlich gegen glatte Muskelzellen der Lamina Media. Weitere experimentelle und klinische Untersuchungen zeigten, dass der A6 Antikörper in atherosklerotischen Mäusen und im Serum erkrankter Patienten signifikant anstiegen. Schließlich wurde eine Impfstrategie mit H2B Autoantigen in Mäusen durchgeführt: ApoE-/- Mäuse entwickelten nach zwei Injektionen eine erhöhte Plaquebelastung ihrer Arterien. Diese Daten zeigen erstmals, dass die Atherosklerose eine Erkrankung ist, die mit einer polyklonalen B2 Autoimmunantwort assoziiert ist. Damit wurde der erste und entscheidende Schritt hinsichtlich der Charakterisierung der Atherosklerose als Autoimmunerkankung gemacht.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 13. Mai 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Steffens, Sabine