WTAP and YTHDC1: non-redundant regulators of adult brain functioning

Stamp, Fabian (2022): WTAP and YTHDC1: non-redundant regulators of adult brain functioning. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Advances in the study of covalent RNA modifications have revealed an essential role for N6-methyladenosine (m6A) in regulating RNA metabolism. It has been shown that m6A is involved in shaping developmental programs and various aspects of cellular functioning. Research on the role of m6A regulation in the brain suggests that it is important for tuning neuronal plasticity and behavior. However, investigations in the mammalian brain have only focused on a few crucial regulators, leaving the contribution of the m6A regulatory protein WTAP and the m6A ‘reader’ YTHDC1 unknown. The research presented in this thesis shows that WTAP and YTHDC1 are non-redundant and important regulators of adult brain functions. The postnatal deletion of WTAP in Camk2aCre expressing projection neurons reveals that WTAP is involved in regulating protein abundance, metabolic state and brain anatomy. WTAP deficient animals show profound changes in protein expression and circulating metabolites as assessed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), indicating a switch in the metabolic state with early glycolysis products being upregulated, and nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) being downregulated across brain regions. The observed molecular changes are associated with striking differences in the circadian activity patterns of knockout (KO) animals, aberrant behavior in classical anxiety tests and are accompanied by volumetric changes in the thalamus and auditory cortex, as determined by magnetic resonance imaging (MRI). Complementing these results, the tamoxifen dependent conditional KO in NexCreERT2 positive cells of the dorsal hippocampus, results in large scale changes in gene expression and splicing. Surprisingly, NexCreERT2 WTAP KO animals do not show a learning impairment in a fear conditioning paradigm but exhibit a significantly increased long-term potentiation (LTP). The comparative study of YTHDC1 using a Camk2aCre expressing mouse line demonstrates the non-redundancy with WTAP. YTHDC1 deficient animals show an overall reduced life expectancy and breeding impairments. KOs exhibit aberrant behaviors across various classical behavior tests measuring anxiety and learning. Structural MRI scans reveal extensive changes in gray matter volume across the cortex and hippocampus. Functionally, KO cells in the medial prefrontal cortex (mPFC) are less sensitive to stimulation as revealed by single cell patching. An LC-MS screening of protein abundance showed large scale region-specific changes in KO animals. Finally, NexCreERT2 KO animals exhibit differential gene expression and splicing. Overall, the presented results demonstrate that WTAP and YTHDC1 are non-redundant regulators of adult brain functioning. Removing either protein results in specific and far-reaching consequences for gene expression, protein abundance, brain anatomy and behavior. The observation that the deletion of WTAP leads to increased LTP and no learning impairment complements studies showing that disturbances of m6A regulation are mostly associated with reduced LTP and learning deficits. The fact that the postnatal deletion of YTHDC1 in Camk2aCre expressing neurons affects life expectancy suggests that YTHDC1 might be involved in METTL3 independent regulatory processes. Together, these findings make a substantial contribution to understanding the role of the m6A regulatory proteins WTAP and YTHDC1 in the mammalian brain.

Abstract

Fortschritte in der Erforschung kovalenter RNA-Modifikationen haben gezeigt, dass N6-methyladenosin (m6A) eine wichtige Rolle in der Regulierung des RNA-Stoffwechsels spielt. Dabei ist m6A unter anderem für die Verarbeitung, den Transport und den Abbau von Boten-RNA (mRNA) wichtig. Forschungsergebnisse zur Rolle der m6A-Regulation im Gehirn legen nahe, dass m6A für die Regulierung neuronaler Plastizität und dem davon abhängigen Lernen wichtig ist. Dabei haben sich die bisherigen Untersuchungen im Gehirn von Mäusen auf einige wenige entscheidende Proteine konzentriert, die zur m6A-bedingten Regulation beitragen. Die Rolle des m6A-regulierenden Proteins WTAP und des m6A Leseproteins YTHDC1 sind bisher unerforscht. Deswegen, war es das Ziel der vorliegenden Dissertation, einen wesentlichen Beitrag zu unserem Verständnis der Funktion von WTAP und YTHDC1 im adulten Gehirn zu leisten. Die hier präsentierten Ergebnisse demonstrieren, dass WTAP und YTHDC1 nicht redundante Regulatoren der Gehirnfunktionen im Erwachsenenalter sind. Die massenspektrometrische Untersuchung (LC-MS) des medialen präfrontalen Cortex (mPFC) sowie des dorsalen und ventralen Hippocampus (dHPC, vHPC), von Tieren mit einer postnatalen Deletion von WTAP in Camk2aCre-exprimierenden Nervenzellen zeigt, dass WTAP an der Einstellung der Proteinkonzentration und der Regulation des Energiestoffwechsels beteiligt ist. Die beobachteten molekularen Veränderungen sind dabei mit markanten Unterschieden in der zirkadianen Aktivität von Knockout (KO) Tieren verbunden, sowie mit Verhaltensveränderungen in klassischen Angstverhaltenstests. Des Weiteren, wurden mithilfe von Magnetresonanztomographie (MRT) volumetrische Veränderungen im Thalamus und im auditorischen Cortex der KO Tiere identifiziert. Ergänzend zu diesen Ergebnissen, führt der tamoxifen-induzierte KO in NexCreERT2 exprimierenden Nervenzellen des dHPC zu weitreichenden Veränderungen in der Genexpression und dem alternativen Spleißen. Überraschenderweise zeigen NexCreERT2 WTAP KO Tiere dabei keine Einschränkungen beim Lernen, aber eine signifikant erhöhte Langzeitpotenzierung (LTP) im dHPC. Der Vergleich mit dem Camk2aCre induzierten KO von YTHDC1 zeigt, dass WTAP und YTHDC1 nicht redundant sind. YTHDC1 KO Tiere haben eine reduzierte Lebenserwartung und zeigen Zuchtbeeinträchtigungen. Die Charakterisierung der YTHDC1 KO Tiere mit verschiedenen klassischen Verhaltenstests deutet auf weitreichende Verhaltensstörungen hin. Die strukturelle Untersuchung des Gehirns mithilfe von MRT offenbart umfangreiche Veränderungen des Volumens der grauen Substanz im Cortex und dHPC. Des Weiteren zeigen elektrophysiologische Messungen, dass Nervenzellen durch den Verlust von YTHDC1 weniger erregbar geworden sind. Die Untersuchung von Proteinen und Stoffwechselprodukten mithilfe von LC-MS deutet darauf hin, dass der Verlust von YTHDC1 zu umfassenden und regional spezifischen Veränderungen im Gehirn führt. Zusätzlich, zeigt die Charakterisierung der Genexpression im dHPC von NexCreERT2 KO-Tiere, dass YTHDC1 für die Regulation der Genexpression und des alternativen Spleißens erforderlich ist. Zusammen deuten die hier präsentierten Ergebnisse darauf hin, dass WTAP und YTHDC1 nicht-redundante Regulatoren im erwachsenen Gehirn sind. Die Entfernung beider Proteine hat spezifische und weitreichende Konsequenzen für die Genexpression, die Proteinkomposition, den Stoffwechsel, die Gehirnanatomie und das Verhalten. Die Beobachtung, dass der Verlust von WTAP zu einer erhöhten LTP und keiner Lernbeeinträchtigung führt, ergänzt Studien, die zeigen, dass Störungen der m6A-Regulation meist mit einem reduziertem LTP und Lerndefiziten einhergehen. Die Tatsache, dass die postnatale Deletion von YTHDC1 die Lebenserwartung verringert, deutet darauf hin, dass YTHDC1 an METTL3-unabhängigen Regulationsprozessen beteiligt sein könnte. Die in dieser Dissertation vorgetragenen Ergebnisse tragen wesentlich zu unserem Verständnis der Funktion der m6A-regulatorischen Proteine WTAP und YTHDC1 im Gehirn von Säugetieren bei.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: N6-Methyladenosine, m6A, WTAP, YTHDC1, epitranscriptome, epitranscriptomic regulation in the adult brain, neuron, behavior, transcriptomics, proteomics, metabolomics, learning and memory
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 10. März 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Chen, Alon