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The long non-coding RNA "upstream to Slitrk3" (RUS) affects chromatin organization by binding to Brd2 and Smarca5
The long non-coding RNA "upstream to Slitrk3" (RUS) affects chromatin organization by binding to Brd2 and Smarca5
Im Laufe der Evolution hat das zentrale Nervensystem der Säugetiere in seiner Komplexität zugenommen. Ebenfalls nahm die Anzahl einer neuen Klasse von RNA- Pol II Transkripten zu, die als lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) definiert sind. Daher wird vermutet, dass lncRNAs für die massive Zunahme der Gehirngröße sowie die Diversifizierung der neuronalen Zelltypen verantwortlich sind \cite{Clark2017}. LncRNAs sind oft Gewebe-spezifisch exprimiert und wirken als zusätzliche Ebene bei der Genregulation. Allerdings ist die biologische Funktion der überwiegenden Mehrheit der Neuronen-spezifischen lncRNAs noch unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, in verschiedenen Transkriptom-Datensätzen nach konservierten, funktional relevanten lncRNAs zu suchen und deren molekularen Mechanismus zu bestimmen. Um die mutmaßlichen biologischen Funktionen möglicher Kandidaten in der Neurogenese zu testen, wurde die jeweilige Expression in sich differenzierenden neuralen Stammzellen mittels lentiviral transduzierten shRNAs im Sinne eines Knockdowns (KD) heruntergefahren. Die erzielten Phänotypen wurden mit einem neuentwickelten Algorithmus ausgewertet. Ein Kandidat, dessen Knockdown (KD) die Anzahl an Neuronen signifikant reduzierte, war eine lncRNA, die im Genom upstream zu Slitrk3 liegt – einem Gen, welches wichtig für die Entwicklung von Neuronen ist - und der wir aufgrund dessen den Namen RUS (RNA upstream to Slitrk3) gegeben haben. Eine detaillierte Bewertung des KD-Phänotyps durch histochemische Färbungen und RNA-Sequenzierung zeigte eine verminderte Zellproliferation, ein Stillstand der Zelldifferenzierung und damit einhergehend ein erhöhtes Zellsterben. RUS ist im Zellkern angereichert und in Maus und Mensch konserviert, insbesondere an seinem 5'-Ende. Die Überexpression von RUS nach KD im Sinne eines Rescue-Experimentes stellte die Bildung von Neuronen wieder her. Die Überexpression einer Deletionskontruktes, dem die konservierte 5'-Domäne fehlte, konnte den KD-Phänotyp jedoch nicht retten. Dies ließ vermuten, dass diese 5’ konservierte Domäne wichtig für die Funktion der lncRNA ist und als Bindestelle für genregulatorische Proteine dient. Um interagierende Proteine zu isolieren und mittels LC-MS zu bestimmen, wurde eine neue in vivo MS2 basierte RNA-Affinitätsaufreinigung entwickelt. Dafür wurden MS2-getaggte RNAs in Neuro2A-Zellen stabil integriert und überexprimiert. Zur Bestimmung der Proteine, die spezifisch an der konservierten Domäne am 5’ Ende binden, wurden diejenigen Proteine aufgereinigt, die an der RUS, der 5’ Deletionsmutante und der Domäne selbst binden. Ein Vergleich der Interaktome dieser drei Konstrukte untereinander ergab, dass RUS mittels seiner 5‘Domäne spezifisch mit den Bet (Bromodomain and Extra-Terminal motif) Proteinen Brd2, Brd4, und dem ISWI (Imitation SWItch) Chromatin-Remodellierer Smarca5 (SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A member 5) interagiert. Brd2 und Smarca5 sind bevorzugt an DNA-Stellen zu finden, die von dem Isolator-Protein CTCF gebunden werden. ChIRP-Seq (Chromatin Isolation by RNA purification coupled with high troughput sequencing) Experimente gegen RUS in Wt Zellen und ChIP-Seq (Chromatin Immunuprecipitation) Experimente gegen Brd2 in ctrl und RUS KD Zellen zeigten, dass RUS und Brd2 gemeinsam an 13 hippocampal spezifischen CTCF Seiten im Genom gebunden haben, die reich an GAATG Wiederholungen sind. Dabei übte RUS weder einen rekrutierenden noch repulsiven Effekt auf Brd2 aus. Die Spezifität von RUS gegenüber dem repetitiven GAATG-Motiv blieb jedoch schwer fassbar. Als Hypothese dient, dass die RUS ihre Ziele während der Transkription erkennt. Dafür konnte ein konserviertes Motiv in der nicht gespleißten Form der RUS gefunden werden, das mit den repetitiven Regionen einen RNA-DNA-Triplex ausbildete. Dieselbe Stelle kann aber auch mit den Transkripten aus repetitiven Regionen RNA-RNA-Doppelstränge bilden. Da RUS im Hippocampus am höchsten exprimiert ist, wurde angenommenen, dass RUS eine aktivierende Funktion auf Smarca5 ausübt. CTCF und Smarca5 ChIP Experimente kombiniert mit quantitativer RT-PCR in ctrl, RUS und Smarca5 KD Zellen bestätigten diese Annahme. Wohingegen der Verlust von Smarca5 zu einer reduzierten Smarca5-Bindung und somit auch zu einer verminderten CTCF-Bindung an allen getesteten CTCF Bindestellen führte, führte der RUS Verlust spezifisch nur an RUS Bindestellen zu einer verminderten CTCF-Bindung. Die Bindung von Smarca5 blieb nach dem RUS KD erhalten. RUS aktiviert möglicherweise die Chromtin-Remodellier-Aktivität von Smarca5 ohne dessen Chromatin Bindung zu regulieren. Dadurch stellt die orts-spezifische Aktivierung des Chromatin-Remodellierens durch lncRNAs einen neuen, vielseitigen und noch nicht beschriebenen Mechanismus für den Organismus dar, um Chromatin zeitlich und lokal spezifisch zu organisieren. Durch die Wechselwirkung mit Brd2 und Brd4 und durch das Zufügen neuer CTCF Stellen, können lncRNAs möglicherweise Enhancer-Promotoren-Schleifen, neue Insulator-Barrieren aufbauen als auch die zellspezifische Chromatin-Organization regulieren, um so ihre regulatorische Funktion auszuüben. Weitere biochemische Experimente sowie die Anwendung neuer Färbetechnik wären nötig, um die Aktivierung des Chromtin-Remodellierens und das Zusammenspiel der RUS mit ihren Interaktionspartnern zu beschreiben., During evolution, the mammalian central nervous system has increased in complexity. Likewise, the number of a new class of RNA Pol II transcripts, defined as long non-coding RNAs (lncRNAs), increased. Therefore, lncRNAs are thought to be responsible for the massive increase in brain size and the diversification of neuronal cell types . LncRNAs are often expressed in a tissue-specific manner and act as an additional layer to increase gene regulation complexity. However, the biological function of the vast majority of neuron-specific lncRNAs is still unknown. This work aimed to search from different transcriptome datasets for conserved functionally relevant lncRNAs and describe their molecular mechanism. To test potential candidates' putative neurogenic functions, we knocked down (KD) their expression in differentiating neural stem cells (NSC). The obtained phenotypes were analyzed using a newly developed algorithm. One candidate whose knockdown (KD) significantly reduced the number of neurons was a lncRNA located upstream to the neurodevelopmental gene Slitrk3, which we named RUS (RNA upstream to Slitrk3) based on this. A detailed assessment of the KD phenotype by histochemical staining and RNA sequencing showed that the KD of RUS resulted in a decreased cell proliferation and an arrest of cell differentiation, concomitant with an increase in cell death. RUS is enriched in the nucleus and conserved in mice and humans, particularly at its 5' end. In a rescue experiment, the overexpression of RUS in KD cells restored neuron formation. However, overexpression of a deletion construct of RUS lacking the conserved 5' domain failed to rescue the KD phenotype. These results suggested that the 5' conserved domain is important for lncRNA function and serves as a binding site for gene regulatory proteins. To isolate interacting proteins and determine them by LC-MS, a newin vivo MS2-based RNA affinity purification was developed. For this, MS2-tagged RNAs were stably integrated and overexpressed in Neuro2A cells. To determine the proteins specifically binding to the conserved domain at the 5' end, I purified proteins binding to the RUS, the 5' deletion mutant, and the domain itself. The three constructs' interacting-proteins were compared to reveal that RUS interacts via its 5' end with the Bet proteins (Bromodomain and Extra-Terminal motif) Brd2, Brd4, the ISWI (Imitation SWItch) chromatin remodeler Smarca5 (SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A member 5). Brd2 and Smarca5 preferentially act at DNA sites bound by the insulator protein CTCF. ChIRP-Seq (Chromatin Isolation by RNA purification coupled with high throughput sequencing) experiments against RUS in Wt cells and ChIP-Seq (Chromatin Immunoprecipitation) experiments against Brd2 in ctrl and RUS KD cells showed that RUS and Brd2 bound together at 13 hippocampal-specific CTCF sites in the genome, rich in GAATG repeats. Here, RUS exerted neither a recruiting nor a repulsive effect on Brd2. However, the specificity of RUS toward the repetitive GAATG motif remains elusive. We hypothesized that RUS recognizes its targets during transcription. In line with this, a conserved motif in the non-spliced form of RUS was found, which should form an RNA-DNA triplex with the repetitive regions. However, the same site can also form RNA-RNA double strands with the transcripts from repetitive regions. Since RUS is most highly expressed in the hippocampus, it was assumed that RUS exerts an activating function on Smarca5. CTCF and Smarca5 ChIP experiments combined with quantitative RT-PCR in ctrl, RUS, and Smacra5 KD cells confirmed this assumption. Whereas a loss of Smarca5 resulted in a reduced Smarca5 binding and a reduced CTCF binding at all CTCF binding sites tested, RUS loss resulted in reduced CTCF binding selectively at RUS binding sites. The binding of Smarca5 after the RUS KD was preserved. RUS possibly activates the chromatin remodeling activity of Smarca5 without regulating its chromatin binding. Thus, site-specific activation of chromatin remodeling by lncRNAs represents a novel and yet undescribed mechanism for the organism to specifically organize chromatin temporally and locally. By interacting with Brd2 and Brd4 and adding new CTCF sites, lncRNAs may be able to establish enhancer-promoter loops, new insulator barriers as well as to regulate cell-specific chromatin organization to exert their regulatory function. Further biochemical experiments and the application of new staining techniques would be needed to confirm the activation of chromatin remodeling and to determine the interplay of RUS with its interacting partners.
Not available
Schneider, Marius
2022
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Schneider, Marius (2022): The long non-coding RNA "upstream to Slitrk3" (RUS) affects chromatin organization by binding to Brd2 and Smarca5. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Licence: Creative Commons: Attribution-NoDerivatives 4.0 (CC-BY-ND)
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Abstract

Im Laufe der Evolution hat das zentrale Nervensystem der Säugetiere in seiner Komplexität zugenommen. Ebenfalls nahm die Anzahl einer neuen Klasse von RNA- Pol II Transkripten zu, die als lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) definiert sind. Daher wird vermutet, dass lncRNAs für die massive Zunahme der Gehirngröße sowie die Diversifizierung der neuronalen Zelltypen verantwortlich sind \cite{Clark2017}. LncRNAs sind oft Gewebe-spezifisch exprimiert und wirken als zusätzliche Ebene bei der Genregulation. Allerdings ist die biologische Funktion der überwiegenden Mehrheit der Neuronen-spezifischen lncRNAs noch unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, in verschiedenen Transkriptom-Datensätzen nach konservierten, funktional relevanten lncRNAs zu suchen und deren molekularen Mechanismus zu bestimmen. Um die mutmaßlichen biologischen Funktionen möglicher Kandidaten in der Neurogenese zu testen, wurde die jeweilige Expression in sich differenzierenden neuralen Stammzellen mittels lentiviral transduzierten shRNAs im Sinne eines Knockdowns (KD) heruntergefahren. Die erzielten Phänotypen wurden mit einem neuentwickelten Algorithmus ausgewertet. Ein Kandidat, dessen Knockdown (KD) die Anzahl an Neuronen signifikant reduzierte, war eine lncRNA, die im Genom upstream zu Slitrk3 liegt – einem Gen, welches wichtig für die Entwicklung von Neuronen ist - und der wir aufgrund dessen den Namen RUS (RNA upstream to Slitrk3) gegeben haben. Eine detaillierte Bewertung des KD-Phänotyps durch histochemische Färbungen und RNA-Sequenzierung zeigte eine verminderte Zellproliferation, ein Stillstand der Zelldifferenzierung und damit einhergehend ein erhöhtes Zellsterben. RUS ist im Zellkern angereichert und in Maus und Mensch konserviert, insbesondere an seinem 5'-Ende. Die Überexpression von RUS nach KD im Sinne eines Rescue-Experimentes stellte die Bildung von Neuronen wieder her. Die Überexpression einer Deletionskontruktes, dem die konservierte 5'-Domäne fehlte, konnte den KD-Phänotyp jedoch nicht retten. Dies ließ vermuten, dass diese 5’ konservierte Domäne wichtig für die Funktion der lncRNA ist und als Bindestelle für genregulatorische Proteine dient. Um interagierende Proteine zu isolieren und mittels LC-MS zu bestimmen, wurde eine neue in vivo MS2 basierte RNA-Affinitätsaufreinigung entwickelt. Dafür wurden MS2-getaggte RNAs in Neuro2A-Zellen stabil integriert und überexprimiert. Zur Bestimmung der Proteine, die spezifisch an der konservierten Domäne am 5’ Ende binden, wurden diejenigen Proteine aufgereinigt, die an der RUS, der 5’ Deletionsmutante und der Domäne selbst binden. Ein Vergleich der Interaktome dieser drei Konstrukte untereinander ergab, dass RUS mittels seiner 5‘Domäne spezifisch mit den Bet (Bromodomain and Extra-Terminal motif) Proteinen Brd2, Brd4, und dem ISWI (Imitation SWItch) Chromatin-Remodellierer Smarca5 (SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A member 5) interagiert. Brd2 und Smarca5 sind bevorzugt an DNA-Stellen zu finden, die von dem Isolator-Protein CTCF gebunden werden. ChIRP-Seq (Chromatin Isolation by RNA purification coupled with high troughput sequencing) Experimente gegen RUS in Wt Zellen und ChIP-Seq (Chromatin Immunuprecipitation) Experimente gegen Brd2 in ctrl und RUS KD Zellen zeigten, dass RUS und Brd2 gemeinsam an 13 hippocampal spezifischen CTCF Seiten im Genom gebunden haben, die reich an GAATG Wiederholungen sind. Dabei übte RUS weder einen rekrutierenden noch repulsiven Effekt auf Brd2 aus. Die Spezifität von RUS gegenüber dem repetitiven GAATG-Motiv blieb jedoch schwer fassbar. Als Hypothese dient, dass die RUS ihre Ziele während der Transkription erkennt. Dafür konnte ein konserviertes Motiv in der nicht gespleißten Form der RUS gefunden werden, das mit den repetitiven Regionen einen RNA-DNA-Triplex ausbildete. Dieselbe Stelle kann aber auch mit den Transkripten aus repetitiven Regionen RNA-RNA-Doppelstränge bilden. Da RUS im Hippocampus am höchsten exprimiert ist, wurde angenommenen, dass RUS eine aktivierende Funktion auf Smarca5 ausübt. CTCF und Smarca5 ChIP Experimente kombiniert mit quantitativer RT-PCR in ctrl, RUS und Smarca5 KD Zellen bestätigten diese Annahme. Wohingegen der Verlust von Smarca5 zu einer reduzierten Smarca5-Bindung und somit auch zu einer verminderten CTCF-Bindung an allen getesteten CTCF Bindestellen führte, führte der RUS Verlust spezifisch nur an RUS Bindestellen zu einer verminderten CTCF-Bindung. Die Bindung von Smarca5 blieb nach dem RUS KD erhalten. RUS aktiviert möglicherweise die Chromtin-Remodellier-Aktivität von Smarca5 ohne dessen Chromatin Bindung zu regulieren. Dadurch stellt die orts-spezifische Aktivierung des Chromatin-Remodellierens durch lncRNAs einen neuen, vielseitigen und noch nicht beschriebenen Mechanismus für den Organismus dar, um Chromatin zeitlich und lokal spezifisch zu organisieren. Durch die Wechselwirkung mit Brd2 und Brd4 und durch das Zufügen neuer CTCF Stellen, können lncRNAs möglicherweise Enhancer-Promotoren-Schleifen, neue Insulator-Barrieren aufbauen als auch die zellspezifische Chromatin-Organization regulieren, um so ihre regulatorische Funktion auszuüben. Weitere biochemische Experimente sowie die Anwendung neuer Färbetechnik wären nötig, um die Aktivierung des Chromtin-Remodellierens und das Zusammenspiel der RUS mit ihren Interaktionspartnern zu beschreiben.

Abstract

During evolution, the mammalian central nervous system has increased in complexity. Likewise, the number of a new class of RNA Pol II transcripts, defined as long non-coding RNAs (lncRNAs), increased. Therefore, lncRNAs are thought to be responsible for the massive increase in brain size and the diversification of neuronal cell types . LncRNAs are often expressed in a tissue-specific manner and act as an additional layer to increase gene regulation complexity. However, the biological function of the vast majority of neuron-specific lncRNAs is still unknown. This work aimed to search from different transcriptome datasets for conserved functionally relevant lncRNAs and describe their molecular mechanism. To test potential candidates' putative neurogenic functions, we knocked down (KD) their expression in differentiating neural stem cells (NSC). The obtained phenotypes were analyzed using a newly developed algorithm. One candidate whose knockdown (KD) significantly reduced the number of neurons was a lncRNA located upstream to the neurodevelopmental gene Slitrk3, which we named RUS (RNA upstream to Slitrk3) based on this. A detailed assessment of the KD phenotype by histochemical staining and RNA sequencing showed that the KD of RUS resulted in a decreased cell proliferation and an arrest of cell differentiation, concomitant with an increase in cell death. RUS is enriched in the nucleus and conserved in mice and humans, particularly at its 5' end. In a rescue experiment, the overexpression of RUS in KD cells restored neuron formation. However, overexpression of a deletion construct of RUS lacking the conserved 5' domain failed to rescue the KD phenotype. These results suggested that the 5' conserved domain is important for lncRNA function and serves as a binding site for gene regulatory proteins. To isolate interacting proteins and determine them by LC-MS, a newin vivo MS2-based RNA affinity purification was developed. For this, MS2-tagged RNAs were stably integrated and overexpressed in Neuro2A cells. To determine the proteins specifically binding to the conserved domain at the 5' end, I purified proteins binding to the RUS, the 5' deletion mutant, and the domain itself. The three constructs' interacting-proteins were compared to reveal that RUS interacts via its 5' end with the Bet proteins (Bromodomain and Extra-Terminal motif) Brd2, Brd4, the ISWI (Imitation SWItch) chromatin remodeler Smarca5 (SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A member 5). Brd2 and Smarca5 preferentially act at DNA sites bound by the insulator protein CTCF. ChIRP-Seq (Chromatin Isolation by RNA purification coupled with high throughput sequencing) experiments against RUS in Wt cells and ChIP-Seq (Chromatin Immunoprecipitation) experiments against Brd2 in ctrl and RUS KD cells showed that RUS and Brd2 bound together at 13 hippocampal-specific CTCF sites in the genome, rich in GAATG repeats. Here, RUS exerted neither a recruiting nor a repulsive effect on Brd2. However, the specificity of RUS toward the repetitive GAATG motif remains elusive. We hypothesized that RUS recognizes its targets during transcription. In line with this, a conserved motif in the non-spliced form of RUS was found, which should form an RNA-DNA triplex with the repetitive regions. However, the same site can also form RNA-RNA double strands with the transcripts from repetitive regions. Since RUS is most highly expressed in the hippocampus, it was assumed that RUS exerts an activating function on Smarca5. CTCF and Smarca5 ChIP experiments combined with quantitative RT-PCR in ctrl, RUS, and Smacra5 KD cells confirmed this assumption. Whereas a loss of Smarca5 resulted in a reduced Smarca5 binding and a reduced CTCF binding at all CTCF binding sites tested, RUS loss resulted in reduced CTCF binding selectively at RUS binding sites. The binding of Smarca5 after the RUS KD was preserved. RUS possibly activates the chromatin remodeling activity of Smarca5 without regulating its chromatin binding. Thus, site-specific activation of chromatin remodeling by lncRNAs represents a novel and yet undescribed mechanism for the organism to specifically organize chromatin temporally and locally. By interacting with Brd2 and Brd4 and adding new CTCF sites, lncRNAs may be able to establish enhancer-promoter loops, new insulator barriers as well as to regulate cell-specific chromatin organization to exert their regulatory function. Further biochemical experiments and the application of new staining techniques would be needed to confirm the activation of chromatin remodeling and to determine the interplay of RUS with its interacting partners.