Role of the large vessel stroke relevant gene HDAC9 in NF-κB activation and atherogenic processes in vascular cells

Bokov, Yury (2022): Role of the large vessel stroke relevant gene HDAC9 in NF-κB activation and atherogenic processes in vascular cells. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Genome-wide association studies identified histone deacetylase 9 (HDAC9) gene region as the strongest risk locus for large vessel stroke (LVS) and a major locus for coronary artery disease (CAD). Substantial advances in our understanding of atherosclerotic plaque formation aid deciphering the complex pathogeneses of both LVS and CAD. In essence, atherosclerosis is a chronic inflammatory disorder of the vascular wall orchestrated by an interplay of vascular resident and immune cells. An insult to the vascular wall results in the production of chemokines and adhesion molecules, leading to lipid-deposition and plaque formation at the lesion site. With these mechanisms in mind, our group recently reported Hdac9-deficiency to attenuate atherosclerosis in ApoE-deficient mice. However, the mechanisms underlying the proatherogenic effect of HDAC9 remain unknown. It is important to consider that previous data already showed HDAC9 to be ubiquitously expressed in endothelial (EC) and smooth muscle cells (SMC). Hence, elucidating the role of these cell types could expand our knowledge about HDAC9-mediated atherogenesis and provide novel precision medicine approaches for LVS. In this thesis we aimed to: (1) examine HDAC9-mediated effects on proatherogenic molecules (VCAM-1, ICAM-1, MCP-1/CCL2 and IL-8) in HDAC9-deficient ECs and SMCs stimulated by TNF-alpha and measure the production of the same chemokines and adhesion molecules in Apoe-/- Hdac9-/- mice; (3) investigate the mechanism linking HDAC9 to pro-inflammatory responses; (4) analyze changes to SMC proliferation affected by reduced HDAC9 expression. Using RT-PCR und western blot, we detected reduced mRNA expression and protein levels of VCAM-1, ICAM-1, MCP-1/CCL2 and IL-8 upon TNF-alpha stimulation in ECs and SMCs transiently transfected with HDAC9 siRNA. Double knockout Apoe-/-Hdac9-/- mice which were fed a lipid- rich diet showed reduced levels of circulating Ccl2, Vcam-1 as well as Icam-1 in whole-aorta lysates. Interestingly, adhesion molecule levels were also reduced in single-knockout Hdac9-deficient mice which were fed the same lipid-rich diet. This emphasizes the sole importance of the Hdac9 gene for proatherogenic molecule production. In order to understand how HDAC9 controls proinflammatory molecule production, we explored the underlying mechanisms that lead to expression of these proteins. NF-kappaB transcriptional activity was measured with a luciferase reporter gene assay and phosphorylation of p65 at Ser468 and Ser536 was detected using western blot. Analysis of nuclear and cytoplasmic p65 levels in ECs that underwent HDAC9 knockdown was also carried out. Our findings demonstrated HDAC9 to enhance NF-kappaB activity, promote efficient p65 nuclear translocation and be essential for sustained phosphorylation at Serine 536 and 468 in both ECs and SMCs. Additionally, HDAC9-mediated effects on two main MAPK signaling pathways were investigated and phosphorylation of p38 and ERK1/2 was shown to be unaffected upon HDAC9 knockdown. Lastly, effects of HDAC9 knockdown on SMC proliferation were investigated. Our data showed a 50% decrease in BrdU incorporation as well as CyclinD1 levels in HDAC9-deficient SMCs stimulated by PDGF-BB and TNF-alpha In light of this data following conclusions can be made: (1) HDAC9 enhances the production of proatherogenic molecules (VCAM-1, ICAM-1, MCP-1/CCL2, IL-8) in EC and SMCs as well as Ccl2, Vcam-1 and Icam-1 in atherosclerosis-prone mice; (2) HDAC9 increases pro-inflammatory responses by enhancing NF-kappaB transcriptional activity and p65 nuclear translocation; (3) HDAC9 is essential for SMC proliferation in a proinflammatory milieu. In summary, we provide new data that expands our understanding of how HDAC9 mediates atherosclerotic plaque formation and increases LVS risk. Finally, we discuss the use of a specific HDAC9 inhibitor as a promising new target-based approach to decrease the development of atherosclerosis by suppressing vascular inflammation.

Abstract

Genom-weite Assoziationsstudien identifizierten Histon Deacetylase 9 (HDAC9) Genregion als den höchsten Risikolocus für den ischämischen Schlaganfall der großen hirnversorgenden Arterien und den Hauptrisikolocus für koronare Herzerkrankung. Erhebliche Fortschritte im Verständnis der atherosklerotischen Plaquebildung helfen bei der Entschlüsselung der komplexen Pathogenese sowohl des LVS als auch der KHK. Atherosklerose ist eine chronische Entzündung der Gefäßwand, die durch das Zusammenspiel von Gefäß- und Immunzellen verursacht wird. Eine Reizung der Gefäßwand bewirkt die Produktion von Chemokinen und Adhäsionsmolekülen, die dann zu Lipidablagerung und schließlich zu Plaquebildung an der Läsionsstelle führen. Erst kürzlich gab unsere Arbeitsgruppe bekannt, wie Atherosklerose bei Apoe-/- Mäusen durch Hdac9-Knockout verhindert werden kann. Die Mechanismen, die der proatherogenen Wirkung von HDAC9 zugrunde liegen, sind jedoch unklar. Aufgrund der ubiquitären HDAC9-Expression in den Zellen des Endothels und der glatten Muskulatur, ist weitere Analyse der zellspezifischen Rollen erforderlich, um die HDAC9-mediierte Atherogenese zu verstehen. Durch diese Erkentnisse würde eine Möglichkeit entstehen, gezielte Therapieoptionenen für den makroangiopathischen ischämischen Schlaganfall zu entwickeln. Die Ziele dieser Arbeit waren: (1) Die Untersuchung der HDAC9-mediierten Effekte auf proatherogene Moleküle (VCAM-1, ICAM-1, MCP-1 / CCL2 und IL-8) in TNF-alpha stimulierten HDAC9-defizienten ECs und SMCs und die Ermessung der gleichen Chemokine und Adhäsionsmoleküle in Apoe-/-Hdac9-/- Mäusen; (2) Die Verlinkung von HDAC9 als mechanistischer Mediator in einem proatherogenen Signalweg; (3) Die Analyse der geminderten HDAC9-Expression auf SMC-Proliferation. Die Analyse der mRNA-Expression und der Proteinmenge mit RT-PCR und Western Blot zeigte eine Reduktion der VCAM-1, ICAM-1, MCP-1 / CCL2 und IL-8 nach einer TNF-alpha-Stimulation in HDAC9-defizienten ECs und SMCs. Ein niedriger Spiegel an zirkulierendem CcI2 sowie aortalen Vcam-1 und Icam-1 konnte bei den Apoe-/-Hdac9-/- Mäusen festgestellt werden, denen eine lipidreiche Kost verabreicht wurde. Zudem sahen wir eine Verminderung der gleichen Adhäsionsmoleküle bei Mäusen mit alleiniger Hdac9-Genstillegung, die eine lipidbilanzierte Kost erhielten. Diese Erkenntnisse belegen die individuelle Zuständigkeit des Hdac9-Gens für die Synthese proatherogener Moleküle. Um die zugrunde liegenden Mechanismen dieser HDAC9-kontrollierten Effekte bestimmen zu können, analysierten wir die Transkriptionsaktivität von NF-kappaB mit Luciferase-Reportergen-Assay sowie die Phosphorylierung von p65 auf Ser468 und Ser536 mit Western Blot. Zusätzlich untersuchten wir nukleare und zytoplasmatische p65-Spiegel in HDAC9-defizienten ECs. Als Ergebnis ließ sich eine Erhöhung der NF-kappaB-Aktivität durch HDAC9 festhalten. Darüber hinaus hielt HDAC9 die erfolgreiche p65-Kerntranslokation sowie die Phosphorylierung an Serin 536- und 468 sowohl in Endothel- als auch in glatten Muskelzellen aufrecht. Anschließend betrachteten wir zwei wichtige MAPK Signalwege, um weitere mögliche HDAC9- mediierte Effekte zu identifizieren. Die Phosphorylierung von p38 und ERK1/2 blieb beim HDAC9-Knockdown unverändert. Schließlich prüften wir die Auswirkungen des HDAC9- Knockdowns auf die SMC-Proliferation. Hier demonstrierten HDAC9-defiziente SMCs eine ca. 50%-ige Senkung der BrdU-Inkorporation und des CyclinD1-Spiegels nach Stimulation mit PDGF- BB und TNF-alpha. Anhand dieser Ergebnisse lässt sich schlussfolgern: (1) Die Transkription von VCAM-1, ICAM-1, MCP-1/CCL2 und IL-8 in vitro sowie Ccl2, Vcam-1 und Icam-1 in vivo durch HDAC9 induziert wird; (2) HDAC9 erhöht pro-inflammatorische Reaktionen durch Steigerung der NF-kappaB- Transkriptionsaktivität und p65-Kerntranslokation; (3) SMC-Proliferation ist im proinflammatorischen Milieu stark von HDAC9 abhängig. Zusammenfassend konnten wir HDAC9 als einen wichtigen Mediator des NF-kappaB Signalwegs identifizieren, der für die Initiierung und Entwicklung von Atherosklerose ausschlaggebend ist. Um die Entwicklung neuer zielbasierter Therapien für die effektive Unterdrückung der Gefäßentzündung einsetzen zu können, ist es entscheidend, dass unser Verständnis für diesen Pathomechanismus stets erweitert wird.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: HDAC9, Atherosklerose, Stroke, Schlaganfall, Ischemisch, Ischemic, NF-kB, NF-kappaB
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 28. April 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Dichgans, Martin