Cell-free genomics reveal intrinsic, cooperative and competitive interactions of chromatin binding proteins

Eggers, Nikolas (2022): Cell-free genomics reveal intrinsic, cooperative and competitive interactions of chromatin binding proteins. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

In Drosophila the transcriptional output of the single male X chromosome must be compen-sated to match the levels presented by the two X chromosomes in females. This process is essential and disturbances lead to male specific lethality. To this end, the Dosage Com-pensation Complex, consisting of 5 protein subunits [MSL1, (Male-Specific-Lethal 1), MSL2, MSL3, MOF (Males-Absent-on-the-First ) and MLE (Maleless)] and a long noncoding RNA [roX (RNA on the X)], binds to high affinity sites (HAS) on the X chromosome through its DNA binding subunit MSL2. From here, the complex distributes to nearby active genes and acetylates H4K16 of their nucleosomes. This ultimately leads to a roughly 2-fold increase in expression of all X chromosomal genes. This process, therefore, depends on precise recognition of the proper binding sites, as demonstrated by MSL2 in vivo, where all binding is to the X chromosome. To this end, and similar to other transcription factors, MSL2 needs to distinguish the few functional binding sites from a large pool of seemingly similar but es-sentially nonfunctional binding sites. However, in in vitro assays, where MSL2 is allowed to freely select its binding sites from genomic DNA, the enrichment of binding sites to the X is only about 50%, while MSL2 still binds the same GA-rich binding motif found in vivo. This work aims to describe which factors are missing to achieve faithful X-chromosomal recognition in vitro, to better understand the processes behind Dosage Compensation Complex targeting in particular and transcription factor binding in general. The results of this work are divided into three major parts. Firstly, it describes “cell-free genomics”. Using a preblastoderm extract of Drosophila embryos (DREX) chromatin is reconstituted on ge-nomic Drosophila DNA in vitro, which can be used as a physiological substrate for tran-scription factor and nucleosome remodelers to interact with. Secondly, MSL2 and a known MSL2 interacting protein, CLAMP (chromatin linked adaptor for MSL proteins), are probed regarding interactions with each other and the DREX-assembled chromatin substrate in vitro. These proteins have been well characterized in vitro and provide a reliable control to test DREX-assembled chromatin. Cell-free genomics allow to directly control the concentra-tion of relevant factors, which gives novel insights into the establishment of X-chromosomal targeting and transcriptions factor cooperation and competition. Here, MSL2 is uniquely suited as a model protein to distinguish between productive and non-productive DNA bind-ing, as all its functional binding sites are located on the X chromosome by definition. Lastly, bioinformatical analyses are performed revealing how complex shape features influence how transcription factors distinguish their targets from a pool of seemingly similar but non-functional binding sites. For MSL2 targeting, the data suggest that certain shape features at functional sites serve not as a positive recognition signal for MSL2 itself, but rather as a negative selection signal against another abundant GA-binding protein, GAF, which would otherwise outcompete MSL2. This negative selection demonstrates a novel concept of broader applicability for how the binding profile of a given transcription factor is sculpted by another unrelated factor through a complex sequence and shape signature.

Abstract

Bei Drosophila muss die Transkriptionsleistung des einzelnen X-Chromosoms in Männchen kompensiert werden, um dem Level der beiden X-Chromosomen bei den Weibchen zu entsprechen. Dieser Vorgang ist überlebensnotwendig und falls er gestört wird führt dies in Männchen zum Tod. Dazu bindet der Dosage Compensation Complex (DCC), beste-hend aus 5 Proteinuntereinheiten [MSL1, (Male-Specific-Lethal 1), MSL2, MSL3, MOF (Ma-les-Absent-on-the-First) und MLE (Maleless)] sowie einer langen nichtkodierenden RNA [roX (RNA auf dem X)], durch seine DNA-bindende Untereinheit MSL2 an Hochaffinitäts-stellen (HAS) auf dem X-Chromosom. Von hier aus erreicht der Komplex benachbarte akti-ve Gene und acetyliert das Lysin an Position 16 in Histon 4 (H4K16) ihrer Nukleosomen. Dies führt letztendlich zu einer etwa 2-fachen Erhöhung der Expression X-chromosomaler Gene. Dieser Prozess hängt daher von der präzisen Erkennung der richtigen Bindungs-stellen ab, was sich bei MSL2 in vivo, wo die Bindung ausschließlich an das X-Chromosom erfolgt, auch beobachten lässt. Zu diesem Zweck, und ähnlich wie bei anderen Transkripti-onsfaktoren, muss MSL2 die wenigen funktionellen Bindungsstellen von einem großen Re-servoir scheinbar ähnlicher, aber nicht-funktioneller Bindungsstellen unterscheiden. Bei in vitro Untersuchungen, bei denen MSL2 seine Bindungsstellen frei aus genomischer DNA auswählen kann, beträgt die Anreicherung der Bindungsstellen an das X-Chromosom je-doch nur etwa 50%, obwohl MSL2 immer noch das gleiche GA-reiche Bindungsmotiv bin-det, das auch in vivo gefunden wurde. Diese Arbeit zielt darauf ab, zu beschreiben, welche Faktoren fehlen, um eine getreue X-chromosomale Erkennung in vitro zu erreichen und um die Prozesse, die hinter der Selekti-on des Dosierungskompensationskomplexes im Besonderen und der Bindung von Tran-skriptionsfaktoren im Allgemeinen liegen, besser zu verstehen. Die Ergebnisse dieser Ar-beit gliedern sich in drei Teile. Zuerst wird die „zellfreie Genomik“ beschrieben. Unter Ver-wendung eines Präblastodermextrakts von Drosophila-Embryonen (DREX) wird Chromatin auf genomischer Drosophila-DNA in vitro rekonstituiert, was dann als physiologisches Substrat für die Interaktion mit Transkriptionsfaktoren und Nukleosomen-Remodellierern verwendet werden kann. Zweitens werden MSL2 und ein bekanntes, mit MSL2 wechselwir-kendes Protein, CLAMP (chromatin linked adapter for MSL proteins), in vitro auf Wechsel-wirkungen miteinander und mit dem DREX-assemblierten Chromatinsubstrat hin unter-sucht. Diese Proteine wurden in vitro bereits gut charakterisiert und bieten eine zuverlässi-ge Kontrolle zum Testen von DREX-assembliertem Chromatin. Zellfreie Genomik ermöglicht die direkte Kontrolle der Konzentration relevanter Faktoren, was neue Einblicke in die Etab-lierung von X-chromosomaler Bindungsstellenselektion und in die Kooperation und Konkur-renz zwischen Transkriptionsfaktoren ermöglicht. Hier ist MSL2 als Modellprotein hervorra-gend geeignet, um zwischen produktiver und unproduktiver DNA-Bindung zu unterschei-den, da sich alle seine funktionellen Bindungsstellen auf dem X-Chromosom befinden. Schließlich wurden bioinformatische Analysen durchgeführt, die zeigen, wie komplexe DNA Formmerkmale beeinflussen wie Transkriptionsfaktoren ihre Ziele von einem Reservoir scheinbar ähnlicher, aber nicht-funktioneller Bindungsstellen unterscheiden. Für die MSL2-Bindungstellenselektion legen die Daten nahe, dass bestimmte „Shape“-Merkmale an funk-tionellen Stellen nicht als positives Erkennungssignal für MSL2 selbst dienen, sondern eher als negatives Selektionssignal gegen ein anderes häufig vorkommendes GA-bindendes Protein, GAF, das ansonsten MSL2 verdrängen würde. Diese negative Selektion demons-triert ein neuartiges Konzept mit breiterer Anwendbarkeit dafür, wie das Bindungsprofil ei-nes Transkriptionsfaktors durch einen anderen, nicht verwandten Faktor mittels einer kom-plexen Sequenz- und „Shape“-Signatur geformt wird.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: chromatin, epigenetics, transcription factors, DNA binding, nucleosome remodelling, genomics, in vitro reconstitution
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 25. März 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Becker, Peter