B-Zellimmunität bei Primären Immundefekten wie den Class Switch Recombination (CSR)-Defekten und dem STAT3-Hyper-IgE-Syndrom

Krätz, Carolin (2022): B-Zellimmunität bei Primären Immundefekten wie den Class Switch Recombination (CSR)-Defekten und dem STAT3-Hyper-IgE-Syndrom. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Beide Publikationen dieser Promotion beschäftigen sich mit primären Immundefekten, zum einen mit dem STAT3-Hyper-IgE-Syndrom (STAT3-HIES) und zum anderen mit den Class switch recombination (CSR)-Defekten. Das zusammenfassende Ziel beider Publikationen war ein besseres Verständnis über die B-Zellimmunität und somit über die adaptive Immunität, einschließlich CSR, B-Zellreifung und IgE Produktion zu erwerben, um so auch Rückschlüsse auf andere Erkrankungen, die mit einem defekten Immunsystem assoziiert sind, ziehen zu können. In der Publikation „Impaired memory B‐cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper‐IgE syndrome” haben wir den Einfluss des STAT3-Signalweges auf die B-Zellimmunantwort untersucht. Den Schwerpunkt der Beobachtung legten wir dabei auf die Durchflusszytometrie-Analyse von B-Zellsubpopulationen und Plasmazellen, in vitro Proliferation und Antikörperproduktion, sowie somatische Hypermutation und die Untersuchung von Lymphknoten- und Knochenmarksgewebe in STAT3-HIES-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Zum ersten Mal konnten wir eine detaillierte Immunphänotypisierung von B-Zellen der STAT3- HIES-Patienten aufzeigen, die ergab, dass IgE+ Gedächtnis-B-Zellen in STAT3-HIES-Patienten prozentual erhöht waren, während andere Gedächtnis-B-Zell-Subpopulationen mit Ausnahme von IgG4+ vermindert waren. Dabei stellte sich heraus, dass unter der Stimulation von CD40L und IL-4 die Proliferation von naiven B-Zellen der Patienten vergleichbar ausfiel zu der von gesunden Kontrollen. Wo hingegen sich unter der zusätzlichen Stimulation mit IL-21 eine deutlich verminderte B-Zellproliferation, sowie eine signifikant reduzierte Sekretion von Immunglobulinen bei den STAT3-HIES-Patienten abzeichnete. Wobei der Unterschied für IgE geringer ausfiel, was vermuten ließ, dass ein direkter Klassenwechsel von naiven B-Zellen zu IgE produzierenden B-Zellen unter Umgehung der Keimzentren erfolgte. Insgesamt konnten wir somit die Abhängigkeit der IL-21-Signaltransduktion von STAT3 bestätigen. Die Transkripte von IgE, IgG1, IgG3 und IgA1 zeigten eine reduzierte somatische Hypermutation im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Zudem konnten wir beobachten, dass Lymphknoten von STAT3-HIES-Patienten eine reguläre Keimzentrumarchitektur mit einer normalen Zellbeschaffenheit aufwiesen. Die Knochenmarksstruktur von STAT3-HIES-Patienten imponierte im Vergleich zu gesunden Kontrollen normal. Auffallend war allerdings der hohe Anteil an IgE+ Plasmazellen im Knochenmark der STAT3-HIES Patienten, der auch die erhöhten, niedrigaffinen IgE Immunglobuline im Serum erklären könnte. Insgesamt betrachtet ist es also STAT3-HIES-Patienten prinzipiell möglich, trotz eines gestörten Signalweges T-Zell-abhängige B-Zell-Antworten in vivo zu generieren. Die Vermutung liegt nahe, dass der Grund für die teilweise erhaltene Funktion daran liegen könnte, dass STAT3-HIES eine autosomale Erkrankung ist und somit die Patienten auch eine normale Kopie des STAT3-Gens in sich tragen. Folglich unterstreicht unser Ergebnis die Wichtigkeit des STAT3-Signalweges im Hinblick auf eine optimale B-Zell-Reifung und B-Zell-Differenzierung. Unser Ergebnis bekräftigt außerdem die Notwendigkeit der Immunglobulinsubstitutionstherapie bei STAT3-HIES-Patienten. Zudem konnten wir durch den Nachweis niedrigaffiner IgE Immunglobuline eine Erklärung für die hohen IgE-Serumwerte bei gleichzeitig meist fehlenden allergischen Symptomen finden. Die Publikation „Class Switch Recombination Defects: impact on B cell maturation and antibody responses” zielte auf ein besseres Verständnis des Zusammenhangs zwischen B-Zell-Phänotyp und Antikörperproduktion in Patienten mit CSRD (Class Switch Recombination Defect) ab. Für unsere Studie untersuchten wir Patienten, die einen CSRD mit Mutationen in den Genen CD40, CD40L, UNG, AID, IκBα oder IKKγ aufwiesen. Zu diesem Zweck immunisierten wir diese CSRD-Patienten mit dem Neoantigen Bakteriophage phiX174 und quantifizierten B-Zell-Subpopulationen, definiert als gesamte Gedächtnis-B-Zellen (CD19+CD27+), IgM-Gedächtnis-B-Zellen (CD19+CD27+IgD+IgM+), geswitchte Gedächtnis-B-Zellen (CD19+CD27+IgD−IgM−) und IgM-only-B-Zellen (CD19+CD27+IgD−IgM+), mittels Durchflusszytometrie. Dabei zeigte sich für die Häufigkeit der Gedächtnis-B-Zellen je nach Art des CSRD und abhängig von der jeweiligen Genvariante ein großes Spektrum, das von einzelnen B-Zellpopulationen im Normalbereich liegend bis kaum vorhanden reichte. Insgesamt betrachtet konnten wir jedoch bei allen Patienten eine stark verminderte Population von geswitchten Gedächtnis-B-Zellen (CD19+CD27+IgM−IgD−) feststellen. Die Antikörperantwort auf den Bakteriophagen fiel bei den untersuchten CSRD Patienten nach der ersten Immunisierung vermindert aus. Nach der zweiten Immunisierung im Abstand von sechs Wochen konnten teilweise Werte im Normbereich erzielt werden. Dabei bestanden die Immunglobulinisotypen im Hinblick auf die Produktion von Bakteriophage-neutralisierenden Antikörpern überwiegend aus IgM mit nur einem sehr geringen Anteil an IgG, was für einen verminderten Klassenwechsel spricht. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass eine deutliche Korrelation zwischen der Häufigkeit von geswitchten Gedächtnis-B-Zellen und der Immunantwort auf den Bakteriophagen in CSRD-Patienten ersichtlich war. Unsere Studie, basierend auf der B-Zell-Phänotypisierung, kann somit eine Entscheidungshilfe bieten, die optimale Therapie für Patienten mit CSRD zu finden. Somit haben unsere Forschungsarbeiten mehr Einblick und Verständnis in die einzelnen Zusammenhänge der B-Zell-Regulation und Immunantwort ermöglicht, um in Zukunft durch dieses Wissen noch bessere Diagnose- und Therapieansätze auf dem Gebiet der primären Immundefekte zu entwickeln und dieses immunologische Wissen auf andere Erkrankungen wie allergische Erkrankungen oder Autoimmunerkrankungen übertragen zu können.

Abstract

This dissertation includes two publications on primary immunodeficiencies - the STAT3-hyper IgE syndrome (STAT3-HIES) and the Class Switch Recombination Defects (CSRDs). Both publications aimed for a better understanding of B cell immunity and therefore of the adaptive immune system including CSR, B cell maturation and IgE production. An additional aim was to draw conclusions about other diseases associated with a defect immune system. In the publication „Impaired memory B‐cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper‐IgE syndrome” we investigated the impact of STAT3 signaling on B cell immune response. For this reason, we assessed blood B and plasma cell subsets by FACS analysis, in vitro proliferation and antibody production, somatic hypermutations in Ig genes and lymph node and bone marrow in STAT3-HIES patients and healthy controls. For the first time, we showed a detailed immunophenotyping of STAT3-HIES patients B cells, revealing an increased percentage of IgE+ memory B cells in STAT3-HIES patients, whereas other memory B cell subsets except IgG4+ were diminished. The proliferation of naïve B cells in STAT3-HIES patients was comparable to those of healthy controls under the stimulation with CD40L and IL-4. While in additional stimulation with IL-21 a clear decrease in B cell proliferation as well as a significant reduced secretion of immunoglobulins in STAT3-HIES patients was noticed. The difference in antibody production was less for IgE which led to the hypothesis that there was a direct switch of naïve B cells to IgE producing B cells bypassing the germinal center. Taken together, we confirmed the dependence of IL-21 signaling on STAT3. The transcripts of IgE, IgG1, IgG3 and IgA1 in STAT3-HIES patients showed reduced somatic hypermutation compared to healthy controls. Furthermore, lymph nodes of STAT3-HIES patients showed normal germinal center architecture and cellular constitution. The bone marrow structural organization was comparable to those of healthy controls, but with a remarkably high amount of IgE+ plasma cells that are suspected to produce low-affinity IgE. Overall, STAT3-HIES patients can generate T-cell-dependent B cell responses in vivo despite impaired STAT3 signaling. The reason for the remaining function might be that STAT3-HIES is an autosomal dominant disease and therefore patients have a normal copy of the STAT3-gene. Our results, however, demonstrated the importance of STAT3 signaling for optimal B cell maturation and differentiation. Furthermore, we confirmed the importance of immunoglobulin substitution therapy in STAT3-HIES patients. Moreover, our results explained the high IgE serum levels with mostly absent allergic symptoms due to reduced specified IgE production. With the publication „Class Switch Recombination Defects: impact on B cell maturation and antibody responses” we aimed for a better understanding how B cell phenotyping correlated with antigen responses in patients with CSRD (Class Switch Recombination Defect). Therefore, we investigated CSRD patients with mutations in the genes CD40, CD40L, UNG, AID, IκBα and IKKγ. CSRD patients were immunized with the neoantigen bacteriophage phiX174 and B cell subpopulations, defined as total memory B cells (CD19+CD27+), IgM-memory B cells (CD19+CD27+IgD+IgM+), switched memory B cells (CD19+CD27+IgD−IgM−) and IgM-only B cells (CD19+CD27+IgD−IgM+), were quantified by multiparameter flow cytometry analysis. Dependent on the CSRD and affected gene variant there was a wide range in the percentage of B cell subpopulations, reaching from normal values to rarely measurable values. Overall, the population of switched memory B cells (CD19+CD27+IgM−IgD−) was severely diminished in all CSRD patients. The immune response to bacteriophage was reduced in all investigated CSRD patients after the first immunization. After the second immunization six weeks later, normal values were detected in part. Phage neutralizing antibodies consisted predominantly of IgM and rarely of IgG as a result of reduced class switching. Taken together, there was a clear correlation between the percentage of switched memory B cells and the immune response to bacteriophage in CSRD patients. Thus, our study, based on B cell phenotyping, offers the possibility to get a rational decision in selecting optimal treatment for CSRD patients. Thus, our results provide more insights in the distinct correlations of B cell regulation and immune response to improve and develop novel approaches in diagnosis and treatment of patients with PID. The knowledge gained from PID may further benefit people with more common diseases such as allergic diseases or immune dysregulations.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: B cell maturation, IgE, STAT3 hyper-IgE syndrome, B cell development, Hyper-IgM syndrome, Class switch recombination defect, CSRD
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 24. Februar 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Renner, Ellen