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In vivo Untersuchungen zerebraler β-Amyloidose und Neuroinflammation mittels Positronen-Emissions-Tomographie in einem Amyloid Mausmodell ohne APP Überexpression
In vivo Untersuchungen zerebraler β-Amyloidose und Neuroinflammation mittels Positronen-Emissions-Tomographie in einem Amyloid Mausmodell ohne APP Überexpression
Die nicht physiologische Überexpression des β-Amyloid (Aβ) Vorläufer Proteins (engl.: Amyloid Precursor Protein, APP) in den bisher etablierten transgenen Amyloid-Mausmodellen der Alzheimer Erkrankung kann in präklinischen Studien zu potenziellen Störfaktoren führen. Das neue Mausmodell APP-NL-G-F enthält ein mutiertes knock-in Konstrukt, wodurch es möglicherweise ein verbessertes Modell der Alzheimer Krankheit für β-Amyloid-fokussierte Behandlungsstudien darstellt. Ziel dieser Doktorarbeit war es, die serielle Kleintier Positronen-Emissions-Tomographie (PET) der β-Amyloidose und Neuroinflammation bei APP-NL-G-F-Mäusen für zukünftige Therapieüberwachungsstudien zu etablieren und zu validieren. Asymmetrien der β-Amyloid-Plaque-Last sind ein bekanntes Phänomen bei klinischen PET-Untersuchungen der Alzheimer Krankheit, wohingegen sie in Amyloid Mausmodellen bisher nicht genauer untersucht wurden. Daher ergab sich als zweites Ziel dieser Doktorarbeit Asymmetrien der β-Amyloid Pathologie in Amyloid Mausmodellen durch Amyloid-Kleintier PET zu untersuchen. Zusätzlich wurde überprüft, ob diese Asymmetrien mit einer mikroglialen Aktivierung assoziiert sind. 41 APP-NL-G-F-Mäuse (20 Homozygote und 21 Heterozygote) und 12 altersgleiche Wildtypen wurden im Alter von 2,5 bis 10 Monaten mittels [18F]-florbetaben Amyloid-PET und [18F]-GE-180 18-kDa Translokatorprotein (TSPO)-PET in einem longitudinalen Studiendesign untersucht. Für Amyloid- und TSPO-PET wurden relative Standard-Aufnahmewerte (engl.: Standardized-Uptake-Value-Ratio, SUVR) für Cortex und Hippocampus berechnet. Die voxelweise Analyse der SUVR-Bilder erfolgte mittels statistisch parametrischem Mapping. Alle Mäuse durchliefen nach ihrem letzten PET Scan einen Test für die räumliche Lernfähigkeit mit Hilfe eines Morris-Wasserlabyrinths. Die abschließende Quantifizierung von fibrillärem β-Amyloid und aktivierter Mikroglia durch (Immun)histochemie und Biochemie diente zur Validierung der PET Ergebnisse. Im Rahmen der zweiten wissenschaftlichen Arbeit wurden 523 Amyloid-PET Scans von fünf verschiedenen Amyloid Mausmodellen (APP/PS1, PS2APP, APP-SL70, APP-NL-G-F und APPswe) zusammen mit 136 TSPO-PET Scans zum Nachweis mikroglialer Aktivierung im Rahmen einer Querschnittsstudie analysiert. Alle PET-Rohdaten stammten aus früheren internen Studien und wurden für diese Arbeit neu aufbereitet. Zwei bilaterale Zielvolumina im Bereich des Vorderhirns wurden für die Berechnung von SUVRs verwendet. Bei transgenen Mausmodellen diente die weiße Substanz als Referenzregion, bei dem knock-in Modell APP-NL-G-F wurde das periaquäduktale Grau als Pseudoreferenzregion gewählt. Aus der unterschiedlichen Traceraufnahme in die jeweiligen Hirnhemisphären wurde der Asymmetrie Index berechnet. Die hochgerechneten erforderlichen Stichprobengrößen wurden zwischen Analysen einzelner und kombinierter Hirnhemisphären verglichen. Abschließend erfolgten Korrelationsanalysen zwischen den Amyloid-PET Asymmetrie Indizes und den TSPO-PET Asymmetrie Indizes. Die ubiquitäre Amyloid-Pathologie im Gehirn der APP-NL-G-F Mäuse erschwerte die Verwendung von zuvor etablierten Referenzregionen, wie dem Kleinhirn oder der weißen Substanz. Unter Verwendung einer Varianzanalyse für beide PET-Tracer zusammen mit (immun)histochemischen Analysen erwies sich das periaqueduktale Grau im Mesencephalon als eine geeignete Pseudo-Referenzregion für beide Tracer. Homozygote APP-NL-G-F-Mäuse wiesen in einem Altersintervall von 7,5 Monaten (10 Monate vs. 2,5 Monate) für Amyloid- (+9,1%; +3,8%) und TSPO-PET (+19,8%; +14,2%) ansteigende SUVRs im Cortex und Hippocampus auf (alle P < 0,05). Heterozygote APP-NL-G-F-Mäuse zeigten keine signifikanten Veränderungen mit zunehmendem Alter. Ein signifikanter positiver Zusammenhang zwischen den Amyloid- und den TSPO-PET Ergebnissen wurde sowohl im Cortex (R = 0,64; P < 0,001) als auch im Hippocampus (R = 0,48; P < 0,05) beobachtet. Erste signifikante Cluster von β-Amyloid-Ablagerungen und mikroglialer Aktivierung konnten bei homozygoten Mäusen im Alter von 5 Monaten mittels der sensitiveren voxelweisen Analyse detektiert werden. (Immun)histochemische Analysen zeigten in den Plaques von APP-NL-G-F-Mäusen im Vergleich zu anderen transgenen Amyloid Mausmodellen einen geringeren Anteil an fibrillärem β-Amyloid. Bei 10 Monate alten homozygoten APP-NL-G-F-Mäusen war die Fluchtlatenzzeit im Wasserlabyrinth im Vergleich zu Wildtypen signifikant erhöht und ging mit einer erhöhten kortikalen TSPO-Radiotracer Aufnahme einher. Die terminalen (immun)histochemischen und biochemischen Messparameter korrelierten stark mit den erhobenen PET-Daten. Zur Detektion relevanter Asymmetrien erfolgte zunächst die Definition von Schwellenwerten auf der Grundlage von PET-Messungen bei Wildtypen. Mittels dieser Methodik wurden in mindestens 30% aller untersuchten Amyloid Mausmodelle stark asymmetrische β-Amyloid-Ablagerungen identifiziert, jedoch mit unterschiedlichem Ausmaß und unterschiedlicher Prädilektion der Lateralisation. Asymmetrien waren mit einer höheren Varianz der Traceraufnahme in den einzelnen Hemisphären verbunden. Dies resultierte in einer höheren erforderlichen Stichprobengröße für die Analyse einzelner Hemisphären im Gegensatz zur kombinierten Messung beider Hirnhemisphären. In keinem der untersuchten Amyloid Mausmodelle konnte ein Zusammenhang zwischen asymmetrischer β-Amyloid-Verteilung und dem Alter der Tiere nachgewiesen werden. In ähnlich starkem Ausmaß (alle R > 0,385, alle P < 0,05) korrelierte die Lateralisation der Amyloid-PET Daten mit der Lateralisation der TSPO-PET Daten in vier untersuchten Amyloid Mausmodellen. Die Bildgebung von APP-NL-G-F-Mäusen mittels Amyloid- und TSPO-PET wird durch eine ubiquitär zerebrale β-Amyloid-Pathologie und eine relativ geringe Fibrillarität der β-Amyloid-Plaques erschwert. Unter Verwendung des periaqueduktialen Graus als Pseudo-Referenzregion ist diese jedoch erfolgreich durchführbar. Die Progression der Alzheimer Neuropathologie kann durch die serielle [18F]-florbetaben und [18F]-GE-180 PET in homozygoten APP-NL-G-F-Mäusen sensitiv detektiert werden, während beim heterozygoten Genotyp nur geringfügige Veränderungen nachweisbar sind. Die kombinierte Anwendung der PET zusammen mit Verhaltenstests im neuen knock-in Alzheimer Mausmodell APP-NL-G-F stellt eine vielversprechende Methode zur präklinischen Evaluierung neuer Therapeutika dar. Asymmetrien der fibrillären Plaque-Neuropathologie konnten in Amyloid Mausmodellen mit einer hohen Häufigkeit nachgewiesen werden. Dieses Phänomen muss bei der Planung und Gestaltung präklinischer Studien berücksichtigt werden, insbesondere wenn einzelne Hemisphären mit ex vivo Methoden untersucht werden. Die fehlende Altersabhängigkeit der asymmetrischen β-Amyloid-Verteilung impliziert, dass genetische Faktoren bei der Entwicklung einer lateralisierten β-Amyloidose bei Alzheimer Mausmodellen zugrunde liegen. Eine begleitende Asymmetrie der mikroglialen Aktivierung weist auf eine neuroinflammatorische Komponente bei der Prädominanz der fibrillären Amyloidose in der jeweiligen Hemisphäre hin.
Alzheimer, Mausmodelle, β-Amyloid, Positronen-Emissions-Tomographie, Neuroinflammation
Sacher, Christian
2022
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Sacher, Christian (2022): In vivo Untersuchungen zerebraler β-Amyloidose und Neuroinflammation mittels Positronen-Emissions-Tomographie in einem Amyloid Mausmodell ohne APP Überexpression. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Die nicht physiologische Überexpression des β-Amyloid (Aβ) Vorläufer Proteins (engl.: Amyloid Precursor Protein, APP) in den bisher etablierten transgenen Amyloid-Mausmodellen der Alzheimer Erkrankung kann in präklinischen Studien zu potenziellen Störfaktoren führen. Das neue Mausmodell APP-NL-G-F enthält ein mutiertes knock-in Konstrukt, wodurch es möglicherweise ein verbessertes Modell der Alzheimer Krankheit für β-Amyloid-fokussierte Behandlungsstudien darstellt. Ziel dieser Doktorarbeit war es, die serielle Kleintier Positronen-Emissions-Tomographie (PET) der β-Amyloidose und Neuroinflammation bei APP-NL-G-F-Mäusen für zukünftige Therapieüberwachungsstudien zu etablieren und zu validieren. Asymmetrien der β-Amyloid-Plaque-Last sind ein bekanntes Phänomen bei klinischen PET-Untersuchungen der Alzheimer Krankheit, wohingegen sie in Amyloid Mausmodellen bisher nicht genauer untersucht wurden. Daher ergab sich als zweites Ziel dieser Doktorarbeit Asymmetrien der β-Amyloid Pathologie in Amyloid Mausmodellen durch Amyloid-Kleintier PET zu untersuchen. Zusätzlich wurde überprüft, ob diese Asymmetrien mit einer mikroglialen Aktivierung assoziiert sind. 41 APP-NL-G-F-Mäuse (20 Homozygote und 21 Heterozygote) und 12 altersgleiche Wildtypen wurden im Alter von 2,5 bis 10 Monaten mittels [18F]-florbetaben Amyloid-PET und [18F]-GE-180 18-kDa Translokatorprotein (TSPO)-PET in einem longitudinalen Studiendesign untersucht. Für Amyloid- und TSPO-PET wurden relative Standard-Aufnahmewerte (engl.: Standardized-Uptake-Value-Ratio, SUVR) für Cortex und Hippocampus berechnet. Die voxelweise Analyse der SUVR-Bilder erfolgte mittels statistisch parametrischem Mapping. Alle Mäuse durchliefen nach ihrem letzten PET Scan einen Test für die räumliche Lernfähigkeit mit Hilfe eines Morris-Wasserlabyrinths. Die abschließende Quantifizierung von fibrillärem β-Amyloid und aktivierter Mikroglia durch (Immun)histochemie und Biochemie diente zur Validierung der PET Ergebnisse. Im Rahmen der zweiten wissenschaftlichen Arbeit wurden 523 Amyloid-PET Scans von fünf verschiedenen Amyloid Mausmodellen (APP/PS1, PS2APP, APP-SL70, APP-NL-G-F und APPswe) zusammen mit 136 TSPO-PET Scans zum Nachweis mikroglialer Aktivierung im Rahmen einer Querschnittsstudie analysiert. Alle PET-Rohdaten stammten aus früheren internen Studien und wurden für diese Arbeit neu aufbereitet. Zwei bilaterale Zielvolumina im Bereich des Vorderhirns wurden für die Berechnung von SUVRs verwendet. Bei transgenen Mausmodellen diente die weiße Substanz als Referenzregion, bei dem knock-in Modell APP-NL-G-F wurde das periaquäduktale Grau als Pseudoreferenzregion gewählt. Aus der unterschiedlichen Traceraufnahme in die jeweiligen Hirnhemisphären wurde der Asymmetrie Index berechnet. Die hochgerechneten erforderlichen Stichprobengrößen wurden zwischen Analysen einzelner und kombinierter Hirnhemisphären verglichen. Abschließend erfolgten Korrelationsanalysen zwischen den Amyloid-PET Asymmetrie Indizes und den TSPO-PET Asymmetrie Indizes. Die ubiquitäre Amyloid-Pathologie im Gehirn der APP-NL-G-F Mäuse erschwerte die Verwendung von zuvor etablierten Referenzregionen, wie dem Kleinhirn oder der weißen Substanz. Unter Verwendung einer Varianzanalyse für beide PET-Tracer zusammen mit (immun)histochemischen Analysen erwies sich das periaqueduktale Grau im Mesencephalon als eine geeignete Pseudo-Referenzregion für beide Tracer. Homozygote APP-NL-G-F-Mäuse wiesen in einem Altersintervall von 7,5 Monaten (10 Monate vs. 2,5 Monate) für Amyloid- (+9,1%; +3,8%) und TSPO-PET (+19,8%; +14,2%) ansteigende SUVRs im Cortex und Hippocampus auf (alle P < 0,05). Heterozygote APP-NL-G-F-Mäuse zeigten keine signifikanten Veränderungen mit zunehmendem Alter. Ein signifikanter positiver Zusammenhang zwischen den Amyloid- und den TSPO-PET Ergebnissen wurde sowohl im Cortex (R = 0,64; P < 0,001) als auch im Hippocampus (R = 0,48; P < 0,05) beobachtet. Erste signifikante Cluster von β-Amyloid-Ablagerungen und mikroglialer Aktivierung konnten bei homozygoten Mäusen im Alter von 5 Monaten mittels der sensitiveren voxelweisen Analyse detektiert werden. (Immun)histochemische Analysen zeigten in den Plaques von APP-NL-G-F-Mäusen im Vergleich zu anderen transgenen Amyloid Mausmodellen einen geringeren Anteil an fibrillärem β-Amyloid. Bei 10 Monate alten homozygoten APP-NL-G-F-Mäusen war die Fluchtlatenzzeit im Wasserlabyrinth im Vergleich zu Wildtypen signifikant erhöht und ging mit einer erhöhten kortikalen TSPO-Radiotracer Aufnahme einher. Die terminalen (immun)histochemischen und biochemischen Messparameter korrelierten stark mit den erhobenen PET-Daten. Zur Detektion relevanter Asymmetrien erfolgte zunächst die Definition von Schwellenwerten auf der Grundlage von PET-Messungen bei Wildtypen. Mittels dieser Methodik wurden in mindestens 30% aller untersuchten Amyloid Mausmodelle stark asymmetrische β-Amyloid-Ablagerungen identifiziert, jedoch mit unterschiedlichem Ausmaß und unterschiedlicher Prädilektion der Lateralisation. Asymmetrien waren mit einer höheren Varianz der Traceraufnahme in den einzelnen Hemisphären verbunden. Dies resultierte in einer höheren erforderlichen Stichprobengröße für die Analyse einzelner Hemisphären im Gegensatz zur kombinierten Messung beider Hirnhemisphären. In keinem der untersuchten Amyloid Mausmodelle konnte ein Zusammenhang zwischen asymmetrischer β-Amyloid-Verteilung und dem Alter der Tiere nachgewiesen werden. In ähnlich starkem Ausmaß (alle R > 0,385, alle P < 0,05) korrelierte die Lateralisation der Amyloid-PET Daten mit der Lateralisation der TSPO-PET Daten in vier untersuchten Amyloid Mausmodellen. Die Bildgebung von APP-NL-G-F-Mäusen mittels Amyloid- und TSPO-PET wird durch eine ubiquitär zerebrale β-Amyloid-Pathologie und eine relativ geringe Fibrillarität der β-Amyloid-Plaques erschwert. Unter Verwendung des periaqueduktialen Graus als Pseudo-Referenzregion ist diese jedoch erfolgreich durchführbar. Die Progression der Alzheimer Neuropathologie kann durch die serielle [18F]-florbetaben und [18F]-GE-180 PET in homozygoten APP-NL-G-F-Mäusen sensitiv detektiert werden, während beim heterozygoten Genotyp nur geringfügige Veränderungen nachweisbar sind. Die kombinierte Anwendung der PET zusammen mit Verhaltenstests im neuen knock-in Alzheimer Mausmodell APP-NL-G-F stellt eine vielversprechende Methode zur präklinischen Evaluierung neuer Therapeutika dar. Asymmetrien der fibrillären Plaque-Neuropathologie konnten in Amyloid Mausmodellen mit einer hohen Häufigkeit nachgewiesen werden. Dieses Phänomen muss bei der Planung und Gestaltung präklinischer Studien berücksichtigt werden, insbesondere wenn einzelne Hemisphären mit ex vivo Methoden untersucht werden. Die fehlende Altersabhängigkeit der asymmetrischen β-Amyloid-Verteilung impliziert, dass genetische Faktoren bei der Entwicklung einer lateralisierten β-Amyloidose bei Alzheimer Mausmodellen zugrunde liegen. Eine begleitende Asymmetrie der mikroglialen Aktivierung weist auf eine neuroinflammatorische Komponente bei der Prädominanz der fibrillären Amyloidose in der jeweiligen Hemisphäre hin.