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Das Fehlen von LGP2 reduziert das antivirale Signal der Immunrezeptoren RIG-I und MDA5 in der Melanomzelllinie 1205lu
Das Fehlen von LGP2 reduziert das antivirale Signal der Immunrezeptoren RIG-I und MDA5 in der Melanomzelllinie 1205lu
Die RIG-I-like Rezeptoren (RLR) bilden eine Gruppe zytosolischer Mustererkennungsrezeptoren, die in der angeborenen antiviralen Immunabwehr nach Erkennung viraler doppelsträngiger RNA, eine Signalkaskade auslösen und zur Aktivierung eines antiviralen Genprograms führen. Hierzu interagieren die aktivierten RLR Rezeptoren RIG-I und MDA5 mithilfe der CARD-Domänen mit dem Adaptermolekül MAVS und führen unter anderem zur Expression von Typ-I-Interferonen. Die Rolle des dritten Rezeptors der RLR-Gruppe, LGP2, ist noch ungeklärt. Durch das Fehlen einer CARD-Domänen kann LGP2 nicht selbstständig eine Signalkaskade auslösen. Im RIG-I-Signalweg werden in der Fachliteratur weitestgehend negative Einflüsse von LGP2 beschrieben, während eine dichotome Rolle im MDA5-Signalweg mit positiver Modulation in basaler Konzentration und inhibitorischer Funktion in gesteigerter Konzentration beschrieben ist. In der vorliegenden Arbeit wurden zur Klärung der Rolle von LGP2 im RLR-Signalweg mithilfe der CRISPR/Cas9 Geneditierung drei LGP2-defiziente Klone der 1205lu Melanomzelllinie generiert, über das Fehlen einer LGP2-Proteinexpression und den Nachweis bialleler frameshift Mutationen validiert und anschließend in Stimulations- und Infektionsversuchen untersucht. Zunächst konnte durch Stimulation der Zellklone auf unterschiedlichen Ebenen im RLR-Signalweg eine Rolle von LGP2 auf oder oberhalb von RIG-I- und MDA5 gezeigt werden. Die positive Interferon-feedback-Schleife war durch das Fehlen von LGP2 nicht beeinflusst. Die LGP2-Defizienz führte zu einer reduzierten Immunaktivität nach Stimulation mit den synthetischen RLR-Liganden Triphosphat-RNA und HMW poly(I:C) und zu reduzierter Expression von Interferon und Interferon-induzierten Genen nach Infektion mit SeV, VSV-M51R und Mengovirus-C19A/C22A. Somit weist das vorliegende loss of function Modell eine modulierende, allerdings nicht essenzielle Rolle von LGP2 in den Signalwegen von RIG-I und MDA5 auf. Das Fehlen von LGP2 führte unerwarteterweise zu einer verminderten Virusreplikation von VSV in 1205lu Zellen, wobei gezeigt werden konnte, dass dies nicht auf erhöhten Zelltod der LGP2-defizienten Klone beruhte. Eine Interaktion zwischen LGP2 und VSV-Ribonukleoprotein-Komplexen (RNP) als möglicher Mechanismus einer Rolle von LGP2 konnte durch EMSA nicht gezeigt werden Diese Ergebnisse lassen sich in ein hypothetisches konzentrationsabhängiges Modell für LGP2 einordnen. In unstimulierter basaler Konzentration übernimmt LGP2 eine positive Rolle in den Signalwegen von RIG-I und MDA5. In höherer Konzentration wirkt LGP2 inhibitorisch auf RIG-I und MDA5, zum Beispiel durch PAMP-Sequestrierung. Insbesondere scheinen der Zeitpunkt während einer Virusinfektion und das Verhältnis von LGP2 und RIG-I/MDA5 die Rolle von LGP2 zu beeinflussen und dessen dichotome Wirkung zu erklären.
LGP2, RIG-I, MDA5, Immunrezeptoren, CRISPR/Cas9
Rädler, Johannes
2022
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Rädler, Johannes (2022): Das Fehlen von LGP2 reduziert das antivirale Signal der Immunrezeptoren RIG-I und MDA5 in der Melanomzelllinie 1205lu. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Die RIG-I-like Rezeptoren (RLR) bilden eine Gruppe zytosolischer Mustererkennungsrezeptoren, die in der angeborenen antiviralen Immunabwehr nach Erkennung viraler doppelsträngiger RNA, eine Signalkaskade auslösen und zur Aktivierung eines antiviralen Genprograms führen. Hierzu interagieren die aktivierten RLR Rezeptoren RIG-I und MDA5 mithilfe der CARD-Domänen mit dem Adaptermolekül MAVS und führen unter anderem zur Expression von Typ-I-Interferonen. Die Rolle des dritten Rezeptors der RLR-Gruppe, LGP2, ist noch ungeklärt. Durch das Fehlen einer CARD-Domänen kann LGP2 nicht selbstständig eine Signalkaskade auslösen. Im RIG-I-Signalweg werden in der Fachliteratur weitestgehend negative Einflüsse von LGP2 beschrieben, während eine dichotome Rolle im MDA5-Signalweg mit positiver Modulation in basaler Konzentration und inhibitorischer Funktion in gesteigerter Konzentration beschrieben ist. In der vorliegenden Arbeit wurden zur Klärung der Rolle von LGP2 im RLR-Signalweg mithilfe der CRISPR/Cas9 Geneditierung drei LGP2-defiziente Klone der 1205lu Melanomzelllinie generiert, über das Fehlen einer LGP2-Proteinexpression und den Nachweis bialleler frameshift Mutationen validiert und anschließend in Stimulations- und Infektionsversuchen untersucht. Zunächst konnte durch Stimulation der Zellklone auf unterschiedlichen Ebenen im RLR-Signalweg eine Rolle von LGP2 auf oder oberhalb von RIG-I- und MDA5 gezeigt werden. Die positive Interferon-feedback-Schleife war durch das Fehlen von LGP2 nicht beeinflusst. Die LGP2-Defizienz führte zu einer reduzierten Immunaktivität nach Stimulation mit den synthetischen RLR-Liganden Triphosphat-RNA und HMW poly(I:C) und zu reduzierter Expression von Interferon und Interferon-induzierten Genen nach Infektion mit SeV, VSV-M51R und Mengovirus-C19A/C22A. Somit weist das vorliegende loss of function Modell eine modulierende, allerdings nicht essenzielle Rolle von LGP2 in den Signalwegen von RIG-I und MDA5 auf. Das Fehlen von LGP2 führte unerwarteterweise zu einer verminderten Virusreplikation von VSV in 1205lu Zellen, wobei gezeigt werden konnte, dass dies nicht auf erhöhten Zelltod der LGP2-defizienten Klone beruhte. Eine Interaktion zwischen LGP2 und VSV-Ribonukleoprotein-Komplexen (RNP) als möglicher Mechanismus einer Rolle von LGP2 konnte durch EMSA nicht gezeigt werden Diese Ergebnisse lassen sich in ein hypothetisches konzentrationsabhängiges Modell für LGP2 einordnen. In unstimulierter basaler Konzentration übernimmt LGP2 eine positive Rolle in den Signalwegen von RIG-I und MDA5. In höherer Konzentration wirkt LGP2 inhibitorisch auf RIG-I und MDA5, zum Beispiel durch PAMP-Sequestrierung. Insbesondere scheinen der Zeitpunkt während einer Virusinfektion und das Verhältnis von LGP2 und RIG-I/MDA5 die Rolle von LGP2 zu beeinflussen und dessen dichotome Wirkung zu erklären.