Second und third harmonic generation imaging von Kopf-Hals-Tumoren

Widmann, Magdalena (2022): Second und third harmonic generation imaging von Kopf-Hals-Tumoren. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Das Ziel dieses Projektes war es, Unterschiede zwischen gesundem und maligne entartetem menschlichen Gewebe des Kopf-Hals-Bereiches mithilfe von Second und Third Harmonic Generation Imaging (SHG und THG) zu erkennen. Veränderungen der Kollagenstruktur und -menge in der Extrazellularmatrix standen dabei im Vordergrund. Es wurden Gewebeschnitte von verschiedenen Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren sowie von gesunder Schleimhaut (n = 10) mit dieser Methode untersucht. SHG und THG sind nichtlineare optische Phänomene: zwei oder drei Photonen (in diesem Projekt typischerweise mit Wellenlängen ≥ 800 nm oder ≥ 1200 nm) werden kohärent an den Kollagenfibrillen der Extrazellularmatrix des Gewebes gestreut und bilden ein Photon mit höherer Harmonie, welches nun nur noch die halbe oder ein Drittel der ursprünglichen Wellenlänge besitzt. SHG und THG basieren auf endogenen Kontrasten und benötigen daher keine weiteren Färbungen des Gewebes. SHG entsteht an nicht-inversionssymmetrischen Strukturen, wie zum Beispiel verschiedenen Kollagen-Subtypen, THG hingegen entsteht an Membrangrenzen. Mit SHG können Veränderungen der Struktur und Zusammensetzung von Kollagenfasern mit hoher Sensitivität und Spezifität dargestellt werden. Mithilfe von THG ergeben sich Informationen über Zell-Zell- und auch Zell-Kollagen-Grenzen, Zellmembranen an sich können ebenfalls dargestellt werden. SHG und THG könnten als aussagekräftige Instrumente verwendet werden, um Karzinome in vivo zu erkennen, ohne das umgebende Gewebe zu schädigen. Da sie auf endogenen Kontrasten und geometrischen Eigenschaften von Gewebe basiert, verursacht diese Art der nichtlinearen Optik keine Schädigung des Gewebes durch Phototoxizität oder Bleichung. Die Gewebeproben wurden direkt nach der operativen Entfernung tiefgefroren, in ein OCT–(optimal cutting temperature) Gemisch eingebettet und mit einem Kryotom in vier Mikrometer dicke Proben geschnitten. Das Gewebe wurde anschließend sowohl mit konventionellen histologischen Methoden wie H.E. und Elastica van Gieson gefärbt, als auch immunhistologisch. Für die Immunhistologie wurde ein Kollagen-Typ 1-spezifischer Antikörper als primärer sowie ein biotinylierter anti-Maus-Antikörper als sekundärer Antikörper verwendet. Für die Untersuchung der gefärbten Schnitte wurde ein Lichtmikroskop benutzt. Nachfolgende Schnitte der Gewebe wurden lediglich mit Hämalaun angefärbt und mittels SHG- und THG-Bildgebung analysiert. Hierfür wurde ein Mehrphotonen-Mikroskop mit einem Titan-Saphir-Laser und einem optisch-parametrischem Oszillator verwendet. Die qualitative Bildanalyse verglich Kollagenfasern, die durch die Immunhistologie sichtbar gemacht wurden mit denen, die das SHG-Verfahren zeigte. Die quantitative Bildanalyse konzentrierte sich auf die Messung des Verhältnisses zwischen vorwärts und rückwärts gestreuten Signalen der histologischen Schnitte am Mehrphotonen-Mikroskop. Dieses Verhältnis, fSHG/bSHG, gibt Aufschluss über die Organisation und Dichte der Kollagenfibrillen. Acht von zehn Proben zeigten eine höhere f/b-Ratio im gesunden als im tumorösen Gewebe. Dies deutet auf einen geringeren Grad der Struktur von Tumorgewebe im Vergleich zu gesundem Gewebe hin. Eine höhere f/b-Ratio kann als eine höhere Ordnung von Kollagenfibrillen im betreffenden Gewebe interpretiert werden. Je höher die f/b-Ratio, desto weniger Streuereignisse von Photonen im Verlauf durch das Gewebe treten auf. Durch die vorwärts gerichteten Detektoren ergibt sich fSHG, also das Signal der durch das Gewebe reichenden Photonen. Rückwärts gerichtete Detektoren ermitteln gestreute Photonen. Lediglich zwei von zehn Proben wiesen eine höhere f/b-Ratio in Tumoren als in gesundem Gewebe auf. Diese zwei Proben zeigten bezüglich der Art des Tumors keine eindeutigen Unterschiede zu den anderen Proben. Es handelte sich jeweils um ein Oropharynx- und ein Hypoharynxkarzinom. Die anderen acht Gewebeproben waren ebenfalls entweder Oro-oder Hypopharynxkarzinome. Für THG wurde diese Art der Auswertung nicht durchgeführt, da die Interpretation der Ordnung speziell von Kollagenfibrillen nur mit SHG möglich ist. In dieser Arbeit liegt der Fokus auf Veränderungen von Kollagenfibrillen von gesundem hin zu Tumorgewebe. Kollagen wird spezifisch mittels SHG dargestellt. THG-Signale der Gewebeproben wurden jedoch dennoch generiert, um ein Gesamtbild des Gewebes zu erhalten. SHG und THG Imaging sind vielversprechende Werkzeuge zur Diagnostik und Therapie von Tumorerkrankungen. Hiermit können Änderungen innerhalb von Tumorgewebe nicht nur auf zellulärer Struktur, sondern auch im Bereich der Extrazellularmatrix erkannt und interpretiert werden. In vivo-Mikroskopie kann aufgrund der gewebeschonenden Eigenschaften einen hilfreichen Mehrwert in der Tumordiagnostik und -therapie erbringen.

Abstract

The project’s goal is to detect differences between healthy and malignant tissue of the human head and neck area by utilizing Second and Third Harmonic Generation Imaging (SHG and THG). The focus lies on changes in the structure and quantity of collagenous extracellular matrix. In this study, we assess post-surgical head and neck squamous cell carcinoma tissue from different patients as well as healthy tissue. SHG and THG are nonlinear optical phenomena: two or three photons (in practice with a wavelength of typically ≥800 nm or ≥1200 nm) are coherently scattered at the extracellular collagen matrix of the tissue to generate a higher harmonic photon with half or one third of the wavelength, respectively. SHG and THG rely on endogenous contrasts. SHG can image changes in the collagenous extracellular matrix structure and composition with great sensitivity and specificity as it emerges from non-centrosymmetric structures such as several collagen types. THG provides information on cell-cell as well as cell-collagen matrix integrity and visualizes cells as well as membrane borders. The sub-resolution fibrillar assembly is revealed through emission directionality. This information is inherent due to the coherence and phase-matching process of SHG. SHG and THG can present a powerful tool to detect carcinoma in vivo, without causing any harm to the surrounding tissue. We examined tissue from patients with head and neck squamous cell carcinoma and tissue from healthy mucosa (each n = 10). The post-surgical tissue samples were snap-frozen, embedded in OCT (optimal cutting temperature) compound and cut with a cryotome into four-micrometer thick samples. The samples were prepared for conventional histological staining procedures and conventional immunohistochemistry methods. The antibody used is specific for collagen-I-type and was combined with a biotinylated anti-mouse-antibody as secondary antibody. Normal light microscopy was utilized for analysis. Consecutive slides of the samples were stained only with hemalaun and analyzed via SHG imaging. A multiphoton microscope with an optical parametric oscillator was used. Qualitative imaging analysis compared collagen matrices detected via immunohistochemistry and SHG. Quantitative imaging analysis measured forward to backward intensity ratio (fSHG/bSHG) of SHG images. This ratio provides information on organization and density of the tissue. THG images were used to develop a holistic image of the tissue. Since THG visualizes membrane borders and cell-cell associations among other things, it was used to complement the overall image of the tissue. An f/b-ratio of THG images was not formed, the interest of f/b focuses on collagen and thus on SHG-signals. Our qualitative and quantitative assessments of the tissue samples demonstrate a structural change of collagen matrix organization from healthy to malignant tissue. Eight out of ten tissue samples showed a lower fSHG/bSHG in malignant compared to healthy tissue. This indicates a structural change of collagen matrix organization from healthy to malignant tissue. A lower f/b ratio indicates greater disorder of collagen fibrils in the tissue of interest. The lower the f/b ratio, the higher the number of scattering events of photons in the tissue. Thus, highly ordered collagen fibrils in tissue show a high f/b ratio. The assessed tissue samples showed a high f/b ratio in healthy tissue, describing highly organized tissue and few scattering events. In reverse, malignant tissue showed a low f/b ratio with many scattering events. This information can be used to broaden the in vivo diagnostic and therapeutic possibilities for HNSCC. Intravital imaging techniques are emerging and can provide a detailed view on the extracellular matrix without being harmful to the tissue. Such techniques can be coupled to existing fiber optic imaging devices and enhance pathology analysis of early stage HNSCC as well as real-time surgical determination of tumor margins. Thus, Second and Third Harmonic Generation Imaging provides broad possibilities to analyze not only the cellular but also the extracellular changes in diseased tissue.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Higher Harmonic Generation Imaging, Mehrphotonenmikroskopie, Kopf-Hals-Tumore
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 13. Januar 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Gires, Olivier