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Immunhistochemische Analyse und Positronen-Emissions-Tomographische Darstellung diffuser Neuroinflammation in murinen Multiple Sklerose Modellen
Immunhistochemische Analyse und Positronen-Emissions-Tomographische Darstellung diffuser Neuroinflammation in murinen Multiple Sklerose Modellen
Ein Ziel der ersten Publikation war die Darstellung diffuser Neurodegeneration mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) in vivo. Ein Protein, welches bei diffuser Neuroinflammation vermehrt exprimiert wird, ist das translocator protein (TSPO). In der Arbeit wurde der TSPO-Ligand [18F]-GE180 sowohl Kontroll- als auch Cuprizone-behandelten Mäusen appliziert und mittels PET visualisiert. Die bildgebenden PET-Daten wurden schließlich mit den histopathologischen Veränderungen in Paraffinschnitten verglichen. Das zweite Ziel war die Identifikation der Zellpopulationen, die hauptsächlich TSPO exprimieren. Hierfür wurden Schnitte Cuprizone-behandelter C57BL/6-Mäuse und transgen veränderter Reporter-Mäuse mittels immunfluoreszierender Doppelfärbungen bzw. anti-TSPO-Färbung analysiert. Neben dem Cuprizone-Modell wendeten wir das EAE-Modell sowie eine Kombination aus beiden (Cup/EAE) an, um experimentell ein Einwandern peripherer Immunzellen zu induzieren und die monozytäre TSPO-Expression zu analysieren. In der Studie konnte gezeigt werden, dass mittels [18F]-GE180-PET die Cuprizone-induzierte Gliazell-Aktivierung sowohl in Regionen mit weißer Substanz als auch in Regionen mit grauer Substanz (Corpus callosum, Cortex, Hippocampus, Thalamus, Caudoputamen) zuverlässig visualisiert werden kann. Immunhistochemisch zeigte sich neben der vermehrten Gliazell-Aktivierung und TSPO-Expression eine vermehrte Demyelinisierung und axonaler Schaden. Innerhalb der weißen Substanz konnte eine höhere TSPO-Expression als in der grauen Substanz beobachtet werden. Insgesamt exprimierten 97% aller Mikroglia-Zellen sowie etwa ein Drittel der Astrozyten TSPO. Obwohl TSPO in der äußeren Mitochondrienmembran exprimiert wird und in direkter Umgebung von axonaler Schädigung ein Anstieg der Mitochondrienzahl beobachtet werden konnte, war hier keine vermehrte TSPO-Expression nachweisbar. Im Cup/EAE Modell wurde TSPO sowohl von Mikroglia als auch von eingewanderten Monozyten exprimiert. Zusammenfassend wurde nachgewiesen, dass der TSPO-Ligand [18F]-GE180 verlässlich und reproduzierbar für die in vivo Visualisierung neuropathologischer Veränderungen im MS Modell genutzt werden kann. Zellpopulationen, die in den verwendeten MS Modellen TSPO exprimieren sind hauptsächlich Mikroglia, aber auch Astrozyten und eingewanderte Monozyten. In der zweiten Studie sollten Bereiche mit vollständiger und reproduzierbarer Demyelinisierung im Cuprizone-Modell nachgewiesen werden, um zukünftige Remyelinisierungsstudien zu erleichtern. Für Remyelinisierungsstudien ist die konsistente und komplette Demyelinisierung eine wichtige Voraussetzung. Da die Demyelinisierung im Cuprizone Modell im Bereich des Corpus callosum auf Höhe des rostralen Hippocampus sehr ausgeprägt ist, wurde diese Region untersucht. Untersuchte Myelin-Proteine waren Proteolipid Protein (PLP), myelin associated glycoprotein (MAG) und 2‘,3‘-cyclic-nucleotide 3‘-phosphodiesterase (CNPase). Antikörper gegen diese Proteine wurden in der Studie zum immunhistochemischen Myelinnachweis nach einer jeweiligen Cuprizone-Behandlung über 1, 3 und 5 Wochen verwendet. Eine Hälfte des Corpus callosum wurde von der Mittellinie ausgehend in 22 Sektoren mit einer Breite von je 100µm eingeteilt. Nach einer 5-wöchigen Behandlung konnte mittels optischer Dichtemessungen der Färbeintensitäten ein signifikanter Rückgang der anti-PLP, anti-MAG und anti-CNPase-Färbungen beobachtet werden. In den lateralen Bereichen des Corpus callosum konnte dabei lediglich eine inkomplette Demyelinisierung nachgewiesen werden. In den medialen Bereichen, jeweils 500µm von der Mittellinie entfernt, zeigte sich hingegen eine komplette und konsistente Demyelinisierung. Wir empfehlen daher für zukünftige Remyelinisierungsstudien, diese mediale Region des Corpus callosum zu verwenden.
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Nack, Anne
2021
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Nack, Anne (2021): Immunhistochemische Analyse und Positronen-Emissions-Tomographische Darstellung diffuser Neuroinflammation in murinen Multiple Sklerose Modellen. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Ein Ziel der ersten Publikation war die Darstellung diffuser Neurodegeneration mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) in vivo. Ein Protein, welches bei diffuser Neuroinflammation vermehrt exprimiert wird, ist das translocator protein (TSPO). In der Arbeit wurde der TSPO-Ligand [18F]-GE180 sowohl Kontroll- als auch Cuprizone-behandelten Mäusen appliziert und mittels PET visualisiert. Die bildgebenden PET-Daten wurden schließlich mit den histopathologischen Veränderungen in Paraffinschnitten verglichen. Das zweite Ziel war die Identifikation der Zellpopulationen, die hauptsächlich TSPO exprimieren. Hierfür wurden Schnitte Cuprizone-behandelter C57BL/6-Mäuse und transgen veränderter Reporter-Mäuse mittels immunfluoreszierender Doppelfärbungen bzw. anti-TSPO-Färbung analysiert. Neben dem Cuprizone-Modell wendeten wir das EAE-Modell sowie eine Kombination aus beiden (Cup/EAE) an, um experimentell ein Einwandern peripherer Immunzellen zu induzieren und die monozytäre TSPO-Expression zu analysieren. In der Studie konnte gezeigt werden, dass mittels [18F]-GE180-PET die Cuprizone-induzierte Gliazell-Aktivierung sowohl in Regionen mit weißer Substanz als auch in Regionen mit grauer Substanz (Corpus callosum, Cortex, Hippocampus, Thalamus, Caudoputamen) zuverlässig visualisiert werden kann. Immunhistochemisch zeigte sich neben der vermehrten Gliazell-Aktivierung und TSPO-Expression eine vermehrte Demyelinisierung und axonaler Schaden. Innerhalb der weißen Substanz konnte eine höhere TSPO-Expression als in der grauen Substanz beobachtet werden. Insgesamt exprimierten 97% aller Mikroglia-Zellen sowie etwa ein Drittel der Astrozyten TSPO. Obwohl TSPO in der äußeren Mitochondrienmembran exprimiert wird und in direkter Umgebung von axonaler Schädigung ein Anstieg der Mitochondrienzahl beobachtet werden konnte, war hier keine vermehrte TSPO-Expression nachweisbar. Im Cup/EAE Modell wurde TSPO sowohl von Mikroglia als auch von eingewanderten Monozyten exprimiert. Zusammenfassend wurde nachgewiesen, dass der TSPO-Ligand [18F]-GE180 verlässlich und reproduzierbar für die in vivo Visualisierung neuropathologischer Veränderungen im MS Modell genutzt werden kann. Zellpopulationen, die in den verwendeten MS Modellen TSPO exprimieren sind hauptsächlich Mikroglia, aber auch Astrozyten und eingewanderte Monozyten. In der zweiten Studie sollten Bereiche mit vollständiger und reproduzierbarer Demyelinisierung im Cuprizone-Modell nachgewiesen werden, um zukünftige Remyelinisierungsstudien zu erleichtern. Für Remyelinisierungsstudien ist die konsistente und komplette Demyelinisierung eine wichtige Voraussetzung. Da die Demyelinisierung im Cuprizone Modell im Bereich des Corpus callosum auf Höhe des rostralen Hippocampus sehr ausgeprägt ist, wurde diese Region untersucht. Untersuchte Myelin-Proteine waren Proteolipid Protein (PLP), myelin associated glycoprotein (MAG) und 2‘,3‘-cyclic-nucleotide 3‘-phosphodiesterase (CNPase). Antikörper gegen diese Proteine wurden in der Studie zum immunhistochemischen Myelinnachweis nach einer jeweiligen Cuprizone-Behandlung über 1, 3 und 5 Wochen verwendet. Eine Hälfte des Corpus callosum wurde von der Mittellinie ausgehend in 22 Sektoren mit einer Breite von je 100µm eingeteilt. Nach einer 5-wöchigen Behandlung konnte mittels optischer Dichtemessungen der Färbeintensitäten ein signifikanter Rückgang der anti-PLP, anti-MAG und anti-CNPase-Färbungen beobachtet werden. In den lateralen Bereichen des Corpus callosum konnte dabei lediglich eine inkomplette Demyelinisierung nachgewiesen werden. In den medialen Bereichen, jeweils 500µm von der Mittellinie entfernt, zeigte sich hingegen eine komplette und konsistente Demyelinisierung. Wir empfehlen daher für zukünftige Remyelinisierungsstudien, diese mediale Region des Corpus callosum zu verwenden.