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A study of molecular mechanisms in direct neuronal reprogramming
A study of molecular mechanisms in direct neuronal reprogramming
The genetic program which instructs neuronal progenitor cells during development to differentiate into neurons has been thoroughly described. However, we are still lacking sufficient understanding of the genetic re-arrangements which occur in cells undergoing fate change in the course of direct neuronal reprogramming. An intriguing question that arises in this context is how similar or different these re-arrangements are between cells from the same or a distinct developmental origin? Therefore, the aim of this study was to identify commonalities and differences in single transcription factor-mediated, direct neuronal reprogramming between cells from the same (astrocytes) and from different germ-layer origin (embryonic fibroblasts). Inducible overexpression of the pro-neural transcription factor Ascl1 triggered morphologically and immunochemically traceable neuronal transdifferentiation in both cell types. However, fibroblasts showed delayed reprogramming kinetics compared to astrocytes along with a lack of detectable progress in neuronal conversion beyond days 5-6 after induction. Whole transcriptome sequencing provided insights into the molecular programs underlying reprogramming and revealed hints to possible causes of impaired reprogramming in fibroblasts. A temporal analysis of the early reprogramming steps uncovered an imbalance of pro- and anti-neurogenic factors during the reprogramming process in fibroblasts which would explain the hurdles in fibroblast transdifferentiation. Interestingly, both in astrocytes and fibroblasts, Ascl1 overexpression initially drives a myogenic transcriptional program which astrocytes appear to terminate more efficiently. Transcriptome data also suggests that both cell types share similarities in their conversion program such as an initial downregulation of genetic factors from their original cell fate and subsequent neural marker gene expression. Intermediate stages are marked by a transcriptional program partially exhibiting traits of adult neural stem cells (reprogramming fibroblasts) and reactive astrocytes (reprogramming astrocytes). Noteworthy is that in both fibroblasts and astrocytes the physiological chronology of Ascl1 direct target gene activation is preserved, while the initiation of transdifferentiation seems to rely on the cell-autonomous mitigation of Notch signalling via Hes6, Dner and Dll3. During subsequent stages of reprogramming, the common differential regulation of eight transcription factors could be observed. From these eight differentially regulated transcription factors, the Id/E-protein bHLH co-factor network was identified as a key pathway for neuronal reprogramming. Correspondingly, it could be shown that E47 overexpression and intracellular BMP-R inhibition rescued the reprogramming efficiency in fibroblasts., Das genetische Programm, welches neuronale Vorläuferzellen während der Embryonalentwicklung anleitet, sich zu Neuronen zu differenzieren, wurde bereits ausführlich beschrieben. Es fehlt uns allerdings noch immer ein ausreichendes Verständnis für die genetischen Umstrukturierungen, die dem zellulären Identitätswechsel während des direkten neuronalen Reprogrammierens zugrunde liegen. Eine faszinierende Frage in diesem Kontext ist, wie ähnlich oder unterschiedlich diese Umstrukturierungen zwischen Zellen desselben oder eines anderen entwicklungsbiologischen Ursprungs sind? Daher war es Ziel dieser Arbeit, die Gemeinsamkeiten und Unterschiede bei der direkten neuronalen Reprogrammierung von Zellen desselben (Astrozyten) und eines fremden Keimblattes (Fibroblasten) mittels eines einzigen Transkriptionsfaktors herauszuarbeiten. Die Überexpression einer induzierbaren Form des pro-neuronalen Transkriptionsfaktors Ascl1 führte zu einer sowohl morphologisch als auch immunzytochemisch nachvollziehbaren Transdifferenzierung beider Zelltypen. Fibroblasten zeigten dabei allerdings ein verzögertes Reprogrammierungsverhalten verglichen mit Astrozyten, sowie keinen erkennbaren Fortschritt in neuronaler Transdifferenzierung jenseits der Tage 5-6 nach Induktion. Eine Sequenzierung des Transkriptoms lieferte Einblicke in die der Reprogrammierung zugrunde liegenden molekularen Regelkreise und erbrachte Hinweise für mögliche Gründe einer Behinderung des Reprogrammierens von Fibroblasten. Eine Analyse der frühen Schritte des Reprogrammierungsprozesses deckte ein Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-neurogenen Faktoren in Fibroblasten auf, das die Hindernisse im Reprogrammieren von Fibroblasten erklären kann. Interessanterweise initiiert die Ascl1-Überexpression sowohl in Astrozyten als auch in Fibroblasten zu Beginn ein alternatives myogenes Transkriptionsprogramm, das in Astrozyten effizienter beendet wird. Die Transkriptom-Daten belegen für reprogrammierende Zellen beiden Ursprungs auch Gemeinsamkeiten im Rahmen der Transdifferenzierung, so beispielsweise einen geordneten Übergang und eine zeitliche Abfolge von charakteristischer Genexpression des Ausgangszelltyps hin zu neuronalen Marker-Genen. Intermediäre Stadien sind durch ein Transkriptionsprogramm gekennzeichnet, das zum Teil Züge adulter neuronaler Stammzellen (reprogrammierende Fibroblasten) und reaktiver Astrozyten (reprogrammierende Astrozyten) zeigt. Beachtenswert und sowohl Fibroblasten als auch Astrozyten gemein ist, dass die physiologische zeitliche Abfolge der direkten Ascl1 Zielgen-Aktivierung erhalten bleibt, während die Initiierung der Transdifferenzierung auf einer zell-autonomen Abschwächung des Notch-Signalwegs mittels Hes6, Dner und Dll3 zu basieren scheint. Im Verlauf der folgenden Stadien des Reprogrammierungsprozesses konnte die gemeinsame differenzielle Regulierung von acht Transkriptionsfaktoren beobachtet werden. Aus diesen acht Transkriptionsfaktoren ergibt sich eine Schlüsselrolle für das Id/E-Protein bHLH Ko-Faktorennetzwerk im Rahmen des direkten neuronalen Reprogrammierens. Entsprechend konnte sowohl mittels Überexpression von E47 als auch mittels intrazellulärer BMP-R Inhibierung ein Rescue der Reprogrammierungsrate in Fibroblasten gezeigt werden.
direct neuronal reprogramming, mouse embryonic fibroblasts, astrocytes, neurogenesis, Ascl1
Casalini, Maria Belen
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Casalini, Maria Belen (2021): A study of molecular mechanisms in direct neuronal reprogramming. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

The genetic program which instructs neuronal progenitor cells during development to differentiate into neurons has been thoroughly described. However, we are still lacking sufficient understanding of the genetic re-arrangements which occur in cells undergoing fate change in the course of direct neuronal reprogramming. An intriguing question that arises in this context is how similar or different these re-arrangements are between cells from the same or a distinct developmental origin? Therefore, the aim of this study was to identify commonalities and differences in single transcription factor-mediated, direct neuronal reprogramming between cells from the same (astrocytes) and from different germ-layer origin (embryonic fibroblasts). Inducible overexpression of the pro-neural transcription factor Ascl1 triggered morphologically and immunochemically traceable neuronal transdifferentiation in both cell types. However, fibroblasts showed delayed reprogramming kinetics compared to astrocytes along with a lack of detectable progress in neuronal conversion beyond days 5-6 after induction. Whole transcriptome sequencing provided insights into the molecular programs underlying reprogramming and revealed hints to possible causes of impaired reprogramming in fibroblasts. A temporal analysis of the early reprogramming steps uncovered an imbalance of pro- and anti-neurogenic factors during the reprogramming process in fibroblasts which would explain the hurdles in fibroblast transdifferentiation. Interestingly, both in astrocytes and fibroblasts, Ascl1 overexpression initially drives a myogenic transcriptional program which astrocytes appear to terminate more efficiently. Transcriptome data also suggests that both cell types share similarities in their conversion program such as an initial downregulation of genetic factors from their original cell fate and subsequent neural marker gene expression. Intermediate stages are marked by a transcriptional program partially exhibiting traits of adult neural stem cells (reprogramming fibroblasts) and reactive astrocytes (reprogramming astrocytes). Noteworthy is that in both fibroblasts and astrocytes the physiological chronology of Ascl1 direct target gene activation is preserved, while the initiation of transdifferentiation seems to rely on the cell-autonomous mitigation of Notch signalling via Hes6, Dner and Dll3. During subsequent stages of reprogramming, the common differential regulation of eight transcription factors could be observed. From these eight differentially regulated transcription factors, the Id/E-protein bHLH co-factor network was identified as a key pathway for neuronal reprogramming. Correspondingly, it could be shown that E47 overexpression and intracellular BMP-R inhibition rescued the reprogramming efficiency in fibroblasts.

Abstract

Das genetische Programm, welches neuronale Vorläuferzellen während der Embryonalentwicklung anleitet, sich zu Neuronen zu differenzieren, wurde bereits ausführlich beschrieben. Es fehlt uns allerdings noch immer ein ausreichendes Verständnis für die genetischen Umstrukturierungen, die dem zellulären Identitätswechsel während des direkten neuronalen Reprogrammierens zugrunde liegen. Eine faszinierende Frage in diesem Kontext ist, wie ähnlich oder unterschiedlich diese Umstrukturierungen zwischen Zellen desselben oder eines anderen entwicklungsbiologischen Ursprungs sind? Daher war es Ziel dieser Arbeit, die Gemeinsamkeiten und Unterschiede bei der direkten neuronalen Reprogrammierung von Zellen desselben (Astrozyten) und eines fremden Keimblattes (Fibroblasten) mittels eines einzigen Transkriptionsfaktors herauszuarbeiten. Die Überexpression einer induzierbaren Form des pro-neuronalen Transkriptionsfaktors Ascl1 führte zu einer sowohl morphologisch als auch immunzytochemisch nachvollziehbaren Transdifferenzierung beider Zelltypen. Fibroblasten zeigten dabei allerdings ein verzögertes Reprogrammierungsverhalten verglichen mit Astrozyten, sowie keinen erkennbaren Fortschritt in neuronaler Transdifferenzierung jenseits der Tage 5-6 nach Induktion. Eine Sequenzierung des Transkriptoms lieferte Einblicke in die der Reprogrammierung zugrunde liegenden molekularen Regelkreise und erbrachte Hinweise für mögliche Gründe einer Behinderung des Reprogrammierens von Fibroblasten. Eine Analyse der frühen Schritte des Reprogrammierungsprozesses deckte ein Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-neurogenen Faktoren in Fibroblasten auf, das die Hindernisse im Reprogrammieren von Fibroblasten erklären kann. Interessanterweise initiiert die Ascl1-Überexpression sowohl in Astrozyten als auch in Fibroblasten zu Beginn ein alternatives myogenes Transkriptionsprogramm, das in Astrozyten effizienter beendet wird. Die Transkriptom-Daten belegen für reprogrammierende Zellen beiden Ursprungs auch Gemeinsamkeiten im Rahmen der Transdifferenzierung, so beispielsweise einen geordneten Übergang und eine zeitliche Abfolge von charakteristischer Genexpression des Ausgangszelltyps hin zu neuronalen Marker-Genen. Intermediäre Stadien sind durch ein Transkriptionsprogramm gekennzeichnet, das zum Teil Züge adulter neuronaler Stammzellen (reprogrammierende Fibroblasten) und reaktiver Astrozyten (reprogrammierende Astrozyten) zeigt. Beachtenswert und sowohl Fibroblasten als auch Astrozyten gemein ist, dass die physiologische zeitliche Abfolge der direkten Ascl1 Zielgen-Aktivierung erhalten bleibt, während die Initiierung der Transdifferenzierung auf einer zell-autonomen Abschwächung des Notch-Signalwegs mittels Hes6, Dner und Dll3 zu basieren scheint. Im Verlauf der folgenden Stadien des Reprogrammierungsprozesses konnte die gemeinsame differenzielle Regulierung von acht Transkriptionsfaktoren beobachtet werden. Aus diesen acht Transkriptionsfaktoren ergibt sich eine Schlüsselrolle für das Id/E-Protein bHLH Ko-Faktorennetzwerk im Rahmen des direkten neuronalen Reprogrammierens. Entsprechend konnte sowohl mittels Überexpression von E47 als auch mittels intrazellulärer BMP-R Inhibierung ein Rescue der Reprogrammierungsrate in Fibroblasten gezeigt werden.