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The role of the kinase mechanistic Target Of Rapamycin – mTOR – and the RNA-binding protein Pumilio2 in epileptogenesis
The role of the kinase mechanistic Target Of Rapamycin – mTOR – and the RNA-binding protein Pumilio2 in epileptogenesis
Genetic factors contributing to epilepsy are still poorly understood. Furthermore, there is no available, effective treatment for many kinds of genetic epilepsy. Recent insights have sparked considerable interest into the role of synaptically translated proteins, in particular their regulation by RNA binding proteins (RBPs), in the pathogenesis of neurologic disorders. At the same time, there is increasing appreciation for the role of the kinase mTOR for neuronal overexcitability, presenting a valuable target for new therapeutic approaches towards intractable epilepsies. To address this important question, I studied the role of mTOR in the epileptogenesis of mice lacking the RBP Pumilio2 (Pum2GT). To this end, I first compared protein expression and localization of mTOR by Western Blot and immunohistochemistry of murine hippocampus of pre-symptomatic and symptomatic Pum2GT animals. Weaned Pum2GT mice, not yet exhibiting an epileptic phenotype, showed decreased mTOR protein levels, while adult Pum2GT mice, which typically experience seizures, did not. Strikingly, Pum2GT mice that underwent memory training and cognitive stress experiments, showed up to five-fold elevations of mTOR protein levels. In addition, expression of targets regulated by Pum2 and mTOR that are associated with epileptogenesis, such as the voltage gated potassium channels Kv1.1 and Kv4.2, were significantly altered in Pum2GT murine hippocampus, pointing to a possible contribution to the epileptic phenotype. Finally, I investigated a possible interaction of Pum2 and mTOR in both murine hippocampus, cultured rat primary hippocampal neurons, and an immortalized neuroblastoma cell line (HN10e). I found a rapamycin-dependent partial colocalization of the Pum2 and mTOR suggesting a potential interplay between both proteins. Collectively, my results provide experimental evidence for disturbed mTOR regulation and function in our mouse model of genetic epilepsy caused by Pum2 deficiency. In particular and consistent with previous studies, the low expression of mTOR in pre-symptomatic mice, and the aberrantly high expression of mTOR in symptomatic animals suggests that decreasing mTOR expression or activity may be protective in epilepsy. Finally, a possible interaction of Pum2 and mTOR proteins and the effect of rapamycin provide a promising foundation for future research on RBP and mTOR in the pathophysiology and potential new treatment options of genetic epilepsy., Noch heute herrscht ein geringes Verständnis und großteils ein gravierender Mangel an effektiven Behandlungsmöglichkeiten genetischer Epilepsien. Neue Erkenntnisse zur Bedeutung von RNA-Bindeproteinen (RBPs) in der Pathogenese neurologischer Erkrankungen wie Epilepsie haben allerdings beträchtliche Aufmerksamkeit erregt. Gleichzeitig findet die Rolle der mTOR Kinase in der neuronalen Hypererregbarkeit zunehmend Anerkennung, wodurch diese zu einem wertvollen Ansatzpunkt für neue therapeutische Konzepte für therapieresistente Epilepsien wird. Ob mTOR in RBP-vermittelter Epileptogenese eine Rolle spielt, ist jedoch bislang unklar. Um dieser Frage anzugehen, untersuchte ich hier die Rolle von mTOR in der Epileptogenese bei Mäusen, die eine verminderte Expression des RBPs Pumilio2 aufweisen (Pum2GT). Zu diesem Zweck verglich ich zunächst mithilfe von Western Blot und Immunhistochemie die Proteinexpression und Lokalisierung von mTOR sowie mehrerer relevanter Zielproteine von Pum2 und mTOR im Hippocampus von präsymptomatischen und symptomatischen Pum2GT Mäusen. Nachwuchs von Pum2GT-Mäusen, die noch keinen epileptischen Phänotyp aufweisen, zeigen eine verminderte mTOR-Proteinexpression, im Gegensatz zu erwachsenen Mäusen, die typischerweise an Anfällen leiden und normale mTOR-Proteinexpression aufweisen. Bemerkenswerterweise zeigen Pum2GT Mäuse, die Gedächtnistraining und kognitivem Stress ausgesetzt wurden, fünffach erhöhte mTOR-Proteinmengen. Zusätzlich fand ich im Hippocampus von Pum2GT Mäusen signifikante Veränderungen der Proteinexpression von Zielproteinen, die durch Pum2 und mTOR reguliert werden, wie etwa die spannungsgesteuerten Kaliumkanäle Kv1.1 und Kv4.2. Zuletzt untersuchte ich eine mögliche Interaktion zwischen Pum2 und mTOR sowohl im Maus-Hippocampus sowie in primären hippocampalen Neuronen der Ratte. Zusätzlich prüfte ich den Effekt einer Rapamycin-Behandlung auf mTOR und Pum2 in einer Neuroblastom-Zellinie (HN10e). Hier kolokalisieren Rapamycin-abhängig mTOR und Pum2, was auf mögliches Zusammenspiel der beiden Proteine hindeutet. Aus diesen Ergebnissen ergeben sich direkte Beweise dafür, dass in unserem Mausmodell für genetische Epilepsie aufgrund von Pum2-Defizienz eine gestörte mTOR-Regulation und Funktion vorliegen. Insbesondere die niedrige Expression von mTOR in präsymptomatischen Mäusen und die unverhältnismäßig hohe Expression von mTOR in stressexponierten, symptomatischen Mäusen weisen darauf hin, dass eine verminderte mTOR-Expression oder -Aktivität protektiv sein könnte, was zu den Ergebnissen anderer Forschungsgruppen passt. Schließlich bieten die mögliche Interaktion zwischen Pum2 und mTOR und der festgestellte Effekt von Rapamycin eine vielversprechende Grundlage für zukünftige Forschungen an RBP und mTOR in der Pathophysiologie und möglicherweise auch für neue Behandlungsoptionen der genetischen Epilepsie.
mTOR, Pumilio2, epilepsy
Pernice, Helena Franziska
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Pernice, Helena Franziska (2021): The role of the kinase mechanistic Target Of Rapamycin – mTOR – and the RNA-binding protein Pumilio2 in epileptogenesis. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Genetic factors contributing to epilepsy are still poorly understood. Furthermore, there is no available, effective treatment for many kinds of genetic epilepsy. Recent insights have sparked considerable interest into the role of synaptically translated proteins, in particular their regulation by RNA binding proteins (RBPs), in the pathogenesis of neurologic disorders. At the same time, there is increasing appreciation for the role of the kinase mTOR for neuronal overexcitability, presenting a valuable target for new therapeutic approaches towards intractable epilepsies. To address this important question, I studied the role of mTOR in the epileptogenesis of mice lacking the RBP Pumilio2 (Pum2GT). To this end, I first compared protein expression and localization of mTOR by Western Blot and immunohistochemistry of murine hippocampus of pre-symptomatic and symptomatic Pum2GT animals. Weaned Pum2GT mice, not yet exhibiting an epileptic phenotype, showed decreased mTOR protein levels, while adult Pum2GT mice, which typically experience seizures, did not. Strikingly, Pum2GT mice that underwent memory training and cognitive stress experiments, showed up to five-fold elevations of mTOR protein levels. In addition, expression of targets regulated by Pum2 and mTOR that are associated with epileptogenesis, such as the voltage gated potassium channels Kv1.1 and Kv4.2, were significantly altered in Pum2GT murine hippocampus, pointing to a possible contribution to the epileptic phenotype. Finally, I investigated a possible interaction of Pum2 and mTOR in both murine hippocampus, cultured rat primary hippocampal neurons, and an immortalized neuroblastoma cell line (HN10e). I found a rapamycin-dependent partial colocalization of the Pum2 and mTOR suggesting a potential interplay between both proteins. Collectively, my results provide experimental evidence for disturbed mTOR regulation and function in our mouse model of genetic epilepsy caused by Pum2 deficiency. In particular and consistent with previous studies, the low expression of mTOR in pre-symptomatic mice, and the aberrantly high expression of mTOR in symptomatic animals suggests that decreasing mTOR expression or activity may be protective in epilepsy. Finally, a possible interaction of Pum2 and mTOR proteins and the effect of rapamycin provide a promising foundation for future research on RBP and mTOR in the pathophysiology and potential new treatment options of genetic epilepsy.

Abstract

Noch heute herrscht ein geringes Verständnis und großteils ein gravierender Mangel an effektiven Behandlungsmöglichkeiten genetischer Epilepsien. Neue Erkenntnisse zur Bedeutung von RNA-Bindeproteinen (RBPs) in der Pathogenese neurologischer Erkrankungen wie Epilepsie haben allerdings beträchtliche Aufmerksamkeit erregt. Gleichzeitig findet die Rolle der mTOR Kinase in der neuronalen Hypererregbarkeit zunehmend Anerkennung, wodurch diese zu einem wertvollen Ansatzpunkt für neue therapeutische Konzepte für therapieresistente Epilepsien wird. Ob mTOR in RBP-vermittelter Epileptogenese eine Rolle spielt, ist jedoch bislang unklar. Um dieser Frage anzugehen, untersuchte ich hier die Rolle von mTOR in der Epileptogenese bei Mäusen, die eine verminderte Expression des RBPs Pumilio2 aufweisen (Pum2GT). Zu diesem Zweck verglich ich zunächst mithilfe von Western Blot und Immunhistochemie die Proteinexpression und Lokalisierung von mTOR sowie mehrerer relevanter Zielproteine von Pum2 und mTOR im Hippocampus von präsymptomatischen und symptomatischen Pum2GT Mäusen. Nachwuchs von Pum2GT-Mäusen, die noch keinen epileptischen Phänotyp aufweisen, zeigen eine verminderte mTOR-Proteinexpression, im Gegensatz zu erwachsenen Mäusen, die typischerweise an Anfällen leiden und normale mTOR-Proteinexpression aufweisen. Bemerkenswerterweise zeigen Pum2GT Mäuse, die Gedächtnistraining und kognitivem Stress ausgesetzt wurden, fünffach erhöhte mTOR-Proteinmengen. Zusätzlich fand ich im Hippocampus von Pum2GT Mäusen signifikante Veränderungen der Proteinexpression von Zielproteinen, die durch Pum2 und mTOR reguliert werden, wie etwa die spannungsgesteuerten Kaliumkanäle Kv1.1 und Kv4.2. Zuletzt untersuchte ich eine mögliche Interaktion zwischen Pum2 und mTOR sowohl im Maus-Hippocampus sowie in primären hippocampalen Neuronen der Ratte. Zusätzlich prüfte ich den Effekt einer Rapamycin-Behandlung auf mTOR und Pum2 in einer Neuroblastom-Zellinie (HN10e). Hier kolokalisieren Rapamycin-abhängig mTOR und Pum2, was auf mögliches Zusammenspiel der beiden Proteine hindeutet. Aus diesen Ergebnissen ergeben sich direkte Beweise dafür, dass in unserem Mausmodell für genetische Epilepsie aufgrund von Pum2-Defizienz eine gestörte mTOR-Regulation und Funktion vorliegen. Insbesondere die niedrige Expression von mTOR in präsymptomatischen Mäusen und die unverhältnismäßig hohe Expression von mTOR in stressexponierten, symptomatischen Mäusen weisen darauf hin, dass eine verminderte mTOR-Expression oder -Aktivität protektiv sein könnte, was zu den Ergebnissen anderer Forschungsgruppen passt. Schließlich bieten die mögliche Interaktion zwischen Pum2 und mTOR und der festgestellte Effekt von Rapamycin eine vielversprechende Grundlage für zukünftige Forschungen an RBP und mTOR in der Pathophysiologie und möglicherweise auch für neue Behandlungsoptionen der genetischen Epilepsie.