Double strike approach for tumor attack: Engineering T cells using CD40L:CD28 chimeric co-stimulatory proteins for enhanced tumor targeting in adoptive cell therapy

Olguín Contreras, Luis Felipe (2021): Double strike approach for tumor attack: Engineering T cells using CD40L:CD28 chimeric co-stimulatory proteins for enhanced tumor targeting in adoptive cell therapy. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Activation of co-stimulatory pathways in cytotoxic T lymphocytes expressing chimeric antigen receptors (CARs) have proven to boost effector activity, tumor rejection and long-term T cell persistence. When using antigen-specific T cell receptors (TCR) instead of CARs, the lack of co-stimulatory signals hampers robust antitumoral response, limiting clinical efficacy. In solid tumors, tumor stroma poses an additional hurdle through hin-drance of infiltration and active inhibition. Our project aims at generating chimeric co-stimulatory proteins (CCPs) consisting of an intracellular co-stimulatory domain (ICD) fused to an extracellular protein domain (ECD) for which ligands are expressed in solid tumors. These CCPs should help bypass the limited antitumoral response by boosting T cell effector functions and stromal attack. In this thesis, the ECD of CD40L protein was selected for combination with the ICD from CD28 protein in different formats. It was expected that the CD40L:CD28 CCPs will not only provide co-stimulation and strengthen the TCR signaling, but also, through the CD40L ECD, facilitate the activation of tumor-resident antigen-presenting cells (APCs), modulate tumor endothelium for improved T cell transmigration and tumor infiltration and induce TCR-MHC independent apoptotic effect on tumor cells. It was a challenge to combine the ECD of CD40L with the ICD of CD28 in one chimeric protein sequence due to the different membrane orientations of the donor proteins. In the thesis, I present solutions to this challenge and describe different CCP formats that were successfully expressed in human T cells along with an antigen-specific TCR. It was observed that the structural design of the CCP strongly influenced intensity and dynamics of surface expression, which showed regulation through activation or antigen-specific stimulation. Ligation of the CCP in the context of TCR-stimulation modulated intracellular signaling cascades along the CD28 pathway including stronger phosphoryla-tion of AKT, mTOR and RPS6, and led to improved TCR-induced cytokine secretion as well as cytotoxicity. Moreover, the CD40L ECD exhibited activity as evidenced by effec-tive maturation and activation of APCs (dendritic cells and B cells). Using a PD-1:CD28 CCP, adoptive T cells transfer was performed in a human melanoma xenograft mouse model. In the solid tumor environment, T cells expressing the PD-1:CD28 CCP showed improved persistence and stronger proliferation, which allowed better tumor control. Based on these results, CD40L:CD28 CCPs constitute a promising tool to be included in the engineering process of T cells to endow them with complemen-tary features, i.e. T cell support and stromal attack, for improved performance in the tu-mor microenvironment.

Abstract

Die Aktivierung von Kostimulationssignalen in zytotoxischen T-Zellen, die mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) ausgestattet wurden, steigerte deren Effektoraktivität und Langzeitpersistenz, und verbesserte die Tumorabstoßung. Effektor-T-Zellen, die anstelle von CAR mit T-Zellrezeptoren (TZR) ausgestattet wurden, exprimieren oft keine Kostimulationsproteine, so dass sie keine Kostimulation erhalten können. Das Fehlen der Kostimulation steht einer robusten antitumoralen Antwort entgegen und schränkt die klinische Effektivität des adoptiven T-Zelltransfers mit TZR-transgenen T-Zellen ein. In soliden Tumoren stellt das Tumorstroma eine weitere Hürde dar, indem es das Eindringen der T-Zellen in den Tumor und die Aktivität der T-Zellen im Tumor vermindert. Ziel dieser Dissertation war es, chimäre Kostimulationsproteine (CCPs) herzustellen, die eine intrazelluläre signalgebende Domäne (ICD) eines Kostimulationsproteins mit der extrazellulären Domäne (ECD) eines anderen Proteins verbinden, für welches im Tumormilieu stimulierende Liganden exprimiert werden. Mit solchen CCPs sollen die Hürden einer effektiven Antitumorantwort bei soliden Tumoren überwunden werden, indem durch die CCPs die T-Zellaktivität verstärkt und gleichzeitig das Tumorstroma angegriffen wird. In dieser Arbeit wurde die ECD des CD40L Proteins gewählt und mit der ICD von CD28 in einem chimären Protein vereinigt. Die Erwartung war, dass das CD40L:CD28 CCP sowohl die Kostimulationskaskade in T-Zellen initiiert und damit das TZR-Signal verstärkt, als auch über die CD40L ECD tumor-residente antigenpräsentierende Zellen (APC) aktiviert, das Tumorendothel verändert, so dass verstärkt T-Zellen transmigrieren und in den Tumor eindringen können, und TZR-MHC unabhängige Apoptose von Tumorzellen auslöst. Die Kombination der ECD von CD40L mit der ICD von CD28 in einem Protein gestaltete sich schwierig, weil die Donorproteine unterschiedliche Membranorientierung besaßen. In dieser Arbeit werden verschiedene Lösungsmöglichkeiten für diese Herausforderung vorgestellt. Es wurden verschiedene Domänenverknüpfungen hergestellt und die Expression der CCP in T-Zellen gemessen. Es wurde beobachtet, dass das strukturelle Design, d.h. die Art und Weise wie die beiden Domänen verknüpft wurden, die Intensität der Expression auf der T-Zelloberfläche beeinflusste. Die Oberflächenexpression der CD40L:CD28 CCP zeigte weiterhin eine durch Aktivierung und antigenspezifische Stimulation regulierbare Dynamik. Die Ligation der CCP im Kontext einer TZR-Stimulation löste entsprechend der Erwartung den Signalweg des CD28 aus, welcher anhand der Phosphorylierung von AKT, mTOR und RPS6 gemessen werden konnte. T-Zellen, die ein CD40L:CD28 CCP exprimierten, sezernierten bei TZR-Stimulation mit gleichzeitiger CCP-Ligation mehr Zytokin und zeigten verstärkte Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen. In Kokulturexperimenten von T-Zellen mit APC (B-Zellen, dendritische Zellen) induzierten T-Zellen, die CD40L:CD28 CCP exprimierten, die Maturierung der dendritischen Zellen und Aktivierung der B-Zellen, womit gezeigt wurde, dass die ECD des CD40L in den chimären Proteinen funktionell integriert war. Zum Nachweis, ob CCP in vivo Aktivität zeigen, wurde ein anderes CCP verwendet, welches ebenfalls die CD28 ICD besaß, diese aber mit der ECD von PD-1 verknüpft war. T-Zellen, die PD-1:CD28 exprimierten, zeigten nach adoptivem Transfer in ein humanes Melanomxenograft deutlich stärkere Proliferation, und das Wachstum des Xenografts wurde verzögert. Sollten sich in zukünftigen in vivo-Experimenten die positiven Ergebnisse des PD-1:CD28 CCP auch für das CD40L:CD28 CCP zeigen lassen, so wäre die Inklusion des CD40L:CD28 CCP in den T-Zell-Engineeringprozess äußerst vielversprechend, weil es die T-Zellen für den adoptiven T-Zelltransfer mit komplementären Eigenschaften aufrüsten wird, die sowohl Unterstützung der T-Zellfunktion als auch Angriff auf das Tumorstroma in Aussicht stellen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: CD40/CD40L, co-stimulation, chimeric switch protein, immune therapy, adoptive cell therapy, dendritic cell maturation, tumor microenvironment, tumor stroma
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 4. Oktober 2021
• 1. Bericht­erstatter:in: Nößner, Elfriede