Der Speicher- und Rezeptor-operierte Ca2+-Einstrom in pulmonale arterielle glatte Muskelzellen und murine Lungenfibroblasten

Bendiks, Larissa (2021): Der Speicher- und Rezeptor-operierte Ca2+-Einstrom in pulmonale arterielle glatte Muskelzellen und murine Lungenfibroblasten. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Ca2+ trägt zur Aufrechterhaltung essentieller Zellfunktionen bei und spielt als „second messenger“ während physiologischer Prozesse eine wichtige Rolle. Die Steuerung dieser Funktionen erfolgt über verschiedene Signalwege, die durch Änderungen der zytosolischen Ca2+-Konzentration initiiert werden. Sowohl der Speicher- als auch der Rezeptor-operierte Ca2+-Einstrom stehen für die Aufnahme von Ca2+ in die Zelle zur Verfügung. Durch eine Dysregulation der Ca2+-Signalwege und der damit einhergehenden gestörten Ca2+-Homöostase kann es zu pathologischen Veränderungen in pulmonalen arteriellen glatten Muskelzellen (PASMC) und primären murinen Lungenfibroblasten (pmLF) kommen. Als Ca2+-Sensor der internen Ca2+-Speicher wird das „stromal interaction molecule“ (STIM)-Protein nach einem Absinken der Ca2+-Konzentration aktiv und bindet an die plasmamembranständigen Orai-Ionenkanäle, wodurch es zu einem Speicher-operierten Ca2+-Einstrom (SOCE) in die Zelle kommt. Die Diacylglycerol (DAG)-vermittelte Aktivierung von „classical transient receptor potential“ (TRPC)-Kanälen führt hingegen zu einem Rezeptor-operierten Ca2+-Einstrom (ROCE). Einige Veröffentlichungen zeigen jedoch eine Beteiligung von TRPC-Kanälen am SCOE in verschiedenen Zelltypen. Aus diesem Grund wurde der Ca2+-Einstrom in TRPC1/6-, TRPC1/3/6- und STIM1/2-defiziente PASMC und pmLF analysiert, um einen möglichen Einfluss von TRPC-Kanäle zu untersuchen. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit wichtige Zellfunktionen sowie die Rolle von STIM1/2-Proteinen und TRPC1/6-Kanälen während der Differenzierung zu Myofibroblasten untersucht. Zur Generierung von STIM1/2-defizienten Zellen wurden STIM1/2flox/flox-pmLF mit Lentiviren infiziert, welche Cre-Rekombinasen exprimierten und zu einer Deletion der STIM-Gene führten. Wie erwartet konnte in STIM1/2-defizienten pmLF ein signifikant reduzierter SOCE gemessen werden, während TRPC1/6- und TRPC1/3/6-defiziente pmLF einen verminderten ROCE aufwiesen. Im Gegensatz dazu kam es weder für den ROCE in STIM1/2-defizienten pmLF noch für den SOCE in TRPC1/6- oder TRPC1/3/6-defizienten pmLF im Vergleich zu den Kontrollzellen zu einem signifikanten Unterschied [1]. Die Analyse des Rezeptor- und Speicher-operierten Ca2+-Einstroms in PASMC ergab ähnliche Ergebnisse wie in pmLF. Auf Grund dieser Daten erscheint eine Beteiligung von TRPC-Kanälen am SOCE in pmLF und PASMC eher unwahrscheinlich. Während STIM1/2-defiziente pmLF, wie erwartet, einen reduzierten Ca2+-Gehalt in den internen Speichern des endoplasmatischen Retikulums aufwiesen, konnte in TRPC1/6-defizienten Zellen erhöhte Ca2+-Konzentrationen in den internen Speichern im Vergleich zu den Kontrollzellen nachgewiesen werden. In Abwesenheit von STIM1/2-Proteinen zeigten pmLF eine reduzierte Zellproliferation und migration sowie eine verminderte Translokation der Transkriptionsfaktoren „nuclear factor of activated T-cells“ c1 und c3 (NFATc1 and c3) in den Zellkern. Im Gegensatz dazu zeigten TRPC1/6-defiziente pmLF im Vergleich zu den Kontrollzellen eine signifikant erhöhte Zellproliferation und -migration. Nach der Behandlung mit „transforming-growth-factor β1“ (TGF-β1) wiesen STIM1/2-defiziente pmLF weder eine signifikant erhöhte Expression von alpha glattem Muskelaktin (α-SMA) noch von Aktinstressfasern im Vergleich zu den Kontrollzellen auf. Demgegenüber wurden in mit TGF-β1 behandelten Myofibroblasten in Abwesenheit von TRPC1/6-Kanälen sowohl eine reduzierte Expressionen von α-SMA als auch von Aktinstressfasern im Vergleich zu den ebenfalls behandelten „Wildtyp“ (Wt)-pmLF gefunden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen zum einen, dass TRPC1/6-Kanälen in PASMC und pmLF nicht am SOCE beteiligt sind und zum anderen, dass eine STIM1/2-Defizienz die Proliferation und Migration der primären Lungenfibroblasten vermindert [1].

Abstract

As an ubiquitous messenger Ca2+ maintains cell functions and plays an important role during physiological processes. These functions are regulated by different Ca2+ signaling pathways initiated by alterations of the intracellular Ca2+ concentrations. Both the store- and the receptor-operated Ca2+ entry present basic processes to generate Ca2+ signals. Dysregulated Ca2+ signaling pathways and disturbed Ca2+-homeostasis can lead to pathological alterations in certain cell types, e.g. in pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMC) and primary lung fibroblasts (pmLF). Stromal interaction molecules (STIM) 1 and 2 proteins are acting as sensors for Ca2+ in intracellular stores and activate Orai channels at the plasma membrane for store-operated Ca2+ entry (SOCE), while classical transient receptor potential (TRPC) channel mediate receptor-operated Ca2+ entry (ROCE). However, several reports indicate a role for TRPC in SOCE in certain cell types. Therefore, Ca2+ influx was analyzed in TRPC1/6 and TRPC1/3/6 deficient (TRPC1/6-/-, TRPC1/3/6-/-) pmLF and PASMC as well as STIM1/2 deficient (STIM1/2ΔpmLF) pmLF to investigate any possible contributions of TRPC channels. Moreover, cell functions of STIM1/2 proteins and TRPC1/6 channels as well as their functions during the transition from pmLF to myofibroblasts were studied. As expected, SOCE was decreased in STIM1/2 deficient pmLF and ROCE was decreased in TRPC1/6-/- and TRPC1/3/6-/- pmLF compared to control cells. By contrast, SOCE was not significantly different in TRPC1/6-/- and TRPC1/3/6-/- pmLF and ROCE was similar in STIM1/2 deficient pmLF compared to control cells [1]. Along these lines, experiments with PASMC showed similar results. In consequence, an interaction to mediate the SOCE in these cells seems unlikely between STIM and TRPC1/6 as well as TRPC1/3/6 channels. While the Ca2+ content in the internal cell stores of the endoplasmatic reticulum (ER) was lower in STIM1/2 deficient pmLF, TRPC1/6 deficient pmLF showed increased Ca2+ levels. Most interestingly, cell proliferation, migration and nuclear localization of the transcription factors nuclear factor of activated T-cells c1 and c3 (NFATc1 and c3) were decreased after ablation of STIM1/2 proteins in pmLF. In clear contrast to these results, lack of TRPC1/6 channels increased cell proliferation and migration. After treatment with „transforming-growth-factor β1“ (TGF-β1) STIM1/2 deficient pmLF showed no significant differences in the expression of alpha smooth muscle actin (α-SMA) or actin stress fibers in comparison to control cells. However, TRPC1/6 deficient pmLF demonstrated significantly less expression of α-SMA and actin stress fibers. In conclusion, TRPC1/6 channels are not involved in SOCE in pmLF as well as PASMC and STIM1/2 deficiency resulted in decreased cell proliferation and migration in pmLF [1].

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: store-operated calcium entry (SOCE), receptor-operated calcium entry (ROCE), stromal interaction molecules (STIM), classical transient receptor potential (TRPC)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 5. Oktober 2021
• 1. Bericht­erstatter:in: Dietrich, Alexander