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FK506-binding protein 11, a novel antibody folding catalyst in plasma cells
FK506-binding protein 11, a novel antibody folding catalyst in plasma cells
Antibodies are glycoproteins produced by terminally differentiated B cells known as plasma cells. They are the central effectors of adaptive immunity, as they specifically bind invading pathogens leading to their neutralization. Besides their substantial function in the immune system, they are used as monoclonal antibodies for the treatment of many diseases, including cancer and autoimmune disorders, and are therefore produced recombinantly in large numbers. In the form of autoantibodies, on the other hand, antibodies may represent disease causing and promoting molecules. All processes mediated by antibodies rely on a functional, three-dimensional structure, which in turn is attained in the endoplasmatic reticulum (ER) and aided by several ER-resident chaperones and folding catalysts. Therefore, a profound knowledge of antibody folding is substantial not only to gain a deeper understanding of the immune system, but also to improve recombinant antibody folding and to develop novel strategies to deal with autoimmune diseases. Still, antibody folding is insufficiently characterized so far. Here, expression, localization, regulation and function of FKBP11, a potential novel antibody folding peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase), was analyzed. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is an interstitial lung disease (ILD) with increasing incidence worldwide and a poor prognosis with median survival rates of 3-5 years upon diagnosis. It is a fibrotic disease defined by an excessive deposition of extracellular matrix (ECM) resulting in an irreversible, ultimately fatal disruption of the lung architecture. Treatment with the Food and Drug Administration (FDA) approved antifibrotic compounds pirfenidone and nintedanib can slow down disease progression, but does not stop it, highlighting the need for a better understanding of this disease along with novel treatment strategies. Importantly, there is emerging evidence of autoimmune features present in IPF, including lymphocytic aggregates within IPF lung tissue and elevated levels of autoantibodies in the serum of IPF patients. A better understanding of these features could provide novel therapeutic targets in the treatment of IPF. Consistent with preceding proteomics data, protein levels of FKBP11 were highly increased in lung tissue of IPF patients. In IPF lungs, immunofluorescence revealed that FKBP11 was specifically expressed by CD27+/CD38+/CD138+/CD3-/CD20-/CD45- plasma cells, the number of which was drastically elevated in IPF lungs. Accordingly, in vitro B cell to plasma cell differentiation induced by a mixture of Interleukin-2 (IL-2) and R848 (resiquimod) was accompanied by an upregulation of FKBP11. More specifically, FKBP11 was upregulated as a part of the unfolded protein response (UPR) in an XBP1-dependent manner, with XBP1 being an important driver of the plasma cell differentiation process. This was assessed by artificial induction of ER stress using tunicamycin upon two different cell lines. Interestingly, prior knockdown of FKBP11 made the cells more susceptible to ER stress induced cell death. Finally, the function of FBKP11 was determined using an in vitro antibody folding assay, showing that addition of human recombinant FKBP11 increased both the speed of antibody folding as well as total yields of correctly folded antibodies. This effect was inhibited by prior incubation of FKBP11 with tacrolimus (FK506). In agreement with a function in antibody folding, knockdown of FKBP11 in an antibody secreting hybridoma cell line reduced antibody levels in the cell culture supernatant. Overall, FKBP11 was identified as a novel, plasma cell specific antibody folding catalyst in IPF. This provides new insights into plasma cell biology and the process of antibody folding, supporting a role of autoimmunity in IPF and allowing for the conception of innovative, targeted therapies not only in IPF, but also in autoimmune disorders. Moreover, these insights may help to overcome present limitations in the production of therapeutic, monoclonal antibodies., Antikörper sind Glykoproteine, die von ausdifferenzierten B-Zellen, den Plasmazellen, produziert werden. Sie sind zentraler Bestandteil des adaptiven Immunsystems, indem sie eingedrungene Erreger binden und somit zu deren Beseitigung führen. Außerdem werden sie als monoklonale Antikörper zur Behandlung vieler Krankheiten, wie etwa Krebs und Autoimmunerkrankungen, genutzt und daher in großen Mengen rekombinant hergestellt. Andererseits können Antikörper auch in Form von Autoantikörpern zur Entstehung von Krankheiten führen und diese aufrecht erhalten. All diese Prozesse, die durch die Bindung von Antikörpern ausgelöst werden, erfordern eine funktionierende, dreidimensionale Struktur des Antikörpers, die unter Zuhilfenahme von Chaperonen und Faltungskatalysatoren im endoplasmatischen Retikulum (ER) entsteht. Daher ist ein tiefgreifendes Verständnis von Antikörperfaltung nicht nur wesentlich, um neue Erkenntnisse zum Immunsystem zu gewinnen, sondern kann auch die rekombinante Herstellung monoklonaler Antikörper verbessern sowie dazu beitragen, neue Strategien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu gewinnen. Bislang ist der Vorgang der Antikörperfaltung jedoch unzureichend dargestellt worden. In dieser Arbeit wurde die Expression, Lokalisation, Regulation sowie Funktion von FKBP11, einer Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase (PPIase), im Hinblick auf eine mögliche Funktion als antikörperfaltendes Enzym analysiert. Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) gehört zu den interstitiellen Lungenerkrankungen (ILDs) und hat eine schlechte Prognose mit einer mittleren Überlebenszeit von 3-5 Jahren bei Diagnosestellung. Die Inzidenz der IPF ist weltweit steigend. Die Krankheit ist gekennzeichnet durch eine zunehmende Vernarbung (Fibrosierung) des Lungengewebes, die durch eine enorme Ablagerung von extrazellulärer Matrix (ECM) gekennzeichnet ist. Dies führt zu einer zunehmenden Zerstörung der Lungenarchitektur, die am Ende zum Tod der Patienten führt. Die derzeit von der Arzneimittelzulassungsbehörde der USA (Food and Drug Administration, FDA) zugelassenen, anti-fibrotischen Medikamente, namentlich Pirfenidon und Nintedanib, verlangsamen lediglich das Voranschreiten der Erkrankung, verhindern es jedoch nicht. Dies verdeutlicht, dass ein besseres Verständnis der IPF notwendig ist, um neue Behandlungsansätze zu identifizieren. Weiterhin wird zunehmend ersichtlich, dass Eigenschaften von Autoimmunerkrankungen in der IPF zu finden sind, wie etwa lymphozytäre Infiltrate in den Lungen der Patienten sowie zirkulierende Autoantikörper im Serum der Patienten. Eine bessere Charakterisierung dieser autoimmunen Eigenschaften in der IPF könnte dazu führen, neue Behandlungsansätze zu verwirklichen. Übereinstimmend mit einer vorhergehenden Proteomikstudie der IPF zeigten Lungengewebeproben von IPF-Patienten höhere Proteinmengen von FKBP11. In der Immunfluoreszenz war ersichtlich, dass FKBP11 in IPF Lungen ausschließlich von Plasmazellen (CD27+/CD38+/CD138+/CD3-/CD20-/CD45-) exprimiert wird. Entsprechend war die Zahl der Plasmazellen in IPF-Lungen deutlich erhöht. Damit übereinstimmend führte eine in vitro Plasmazelldifferenzierung mithilfe von Interleukin-2 (IL-2) und R848 (Resiquimod) zu einer Hochregulierung von FKBP11. Eine künstliche Herbeiführung von ER-Stress mittels Tunicamycin in zwei unabhängigen Zelllinien führte zur Hochregulierung der ungefalteten Protein-Antwort (UPR) und zeigte auf, dass FKBP11 als Teil der UPR in der Plasmazelldifferenzierung hochreguliert wird. Genauer noch bestätigte der vorhergehende Knockdown von XBP1, einem wichtigen Transkriptionsfaktor der Plasmazelldifferenzierung, dass die Hochregulierung von FKBP11 über XBP1 vermittelt wird. Weiterhin zeigte sich bei Herbeiführung von ER-Stress nach vorhergehendem Knockdown von FKBP11 eine erhöhte Empfindlichkeit der Zellen gegenüber ER-Stress-induziertem Zelltod. Letztlich konnte durch ein in vitro Antikörperfaltungssystem demonstriert werden, dass rekombinantes, humanes FKBP11 die Fähigkeit besitzt, Antikörper in vitro zu falten, da es sowohl den Faltungsprozess selbst beschleunigte, als auch den Ertrag an korrekt gefalteten Antikörpern steigerte. Diese Effekte konnten durch vorhergehende Inkubation von FKBP11 mit Tacrolimus (FK506) verhindert werden. Damit übereinstimmend führte ein Knockdown von FKBP11 in einer antikörperproduzierenden Hybridomzelllinie zu geringeren Antikörperkonzentrationen im Zellkulturüberstand. Abschließend lässt sich sagen, dass mit FKBP11 ein neuartiges Protein identifiziert wurde, das in der Lage ist, Antikörper in Plasmazellen zu falten. Dies gewährt neuartige Einblicke in die Biologie der Plasmazelle sowie den Prozess der Antikörperfaltung, und unterstützt weiterhin die Rolle von Autoimmunität in der IPF. Dies ermöglicht die Entwicklung neuartiger Therapieansätze, sowohl in der Behandlung der IPF, als auch in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Darüber hinaus können diese Erkenntnisse dazu beitragen, die Herstellung rekombinanter, monoklonaler Antikörper zu verbessern.
Not available
Preisendörfer, Stefan
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Preisendörfer, Stefan (2021): FK506-binding protein 11, a novel antibody folding catalyst in plasma cells. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Antibodies are glycoproteins produced by terminally differentiated B cells known as plasma cells. They are the central effectors of adaptive immunity, as they specifically bind invading pathogens leading to their neutralization. Besides their substantial function in the immune system, they are used as monoclonal antibodies for the treatment of many diseases, including cancer and autoimmune disorders, and are therefore produced recombinantly in large numbers. In the form of autoantibodies, on the other hand, antibodies may represent disease causing and promoting molecules. All processes mediated by antibodies rely on a functional, three-dimensional structure, which in turn is attained in the endoplasmatic reticulum (ER) and aided by several ER-resident chaperones and folding catalysts. Therefore, a profound knowledge of antibody folding is substantial not only to gain a deeper understanding of the immune system, but also to improve recombinant antibody folding and to develop novel strategies to deal with autoimmune diseases. Still, antibody folding is insufficiently characterized so far. Here, expression, localization, regulation and function of FKBP11, a potential novel antibody folding peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase), was analyzed. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is an interstitial lung disease (ILD) with increasing incidence worldwide and a poor prognosis with median survival rates of 3-5 years upon diagnosis. It is a fibrotic disease defined by an excessive deposition of extracellular matrix (ECM) resulting in an irreversible, ultimately fatal disruption of the lung architecture. Treatment with the Food and Drug Administration (FDA) approved antifibrotic compounds pirfenidone and nintedanib can slow down disease progression, but does not stop it, highlighting the need for a better understanding of this disease along with novel treatment strategies. Importantly, there is emerging evidence of autoimmune features present in IPF, including lymphocytic aggregates within IPF lung tissue and elevated levels of autoantibodies in the serum of IPF patients. A better understanding of these features could provide novel therapeutic targets in the treatment of IPF. Consistent with preceding proteomics data, protein levels of FKBP11 were highly increased in lung tissue of IPF patients. In IPF lungs, immunofluorescence revealed that FKBP11 was specifically expressed by CD27+/CD38+/CD138+/CD3-/CD20-/CD45- plasma cells, the number of which was drastically elevated in IPF lungs. Accordingly, in vitro B cell to plasma cell differentiation induced by a mixture of Interleukin-2 (IL-2) and R848 (resiquimod) was accompanied by an upregulation of FKBP11. More specifically, FKBP11 was upregulated as a part of the unfolded protein response (UPR) in an XBP1-dependent manner, with XBP1 being an important driver of the plasma cell differentiation process. This was assessed by artificial induction of ER stress using tunicamycin upon two different cell lines. Interestingly, prior knockdown of FKBP11 made the cells more susceptible to ER stress induced cell death. Finally, the function of FBKP11 was determined using an in vitro antibody folding assay, showing that addition of human recombinant FKBP11 increased both the speed of antibody folding as well as total yields of correctly folded antibodies. This effect was inhibited by prior incubation of FKBP11 with tacrolimus (FK506). In agreement with a function in antibody folding, knockdown of FKBP11 in an antibody secreting hybridoma cell line reduced antibody levels in the cell culture supernatant. Overall, FKBP11 was identified as a novel, plasma cell specific antibody folding catalyst in IPF. This provides new insights into plasma cell biology and the process of antibody folding, supporting a role of autoimmunity in IPF and allowing for the conception of innovative, targeted therapies not only in IPF, but also in autoimmune disorders. Moreover, these insights may help to overcome present limitations in the production of therapeutic, monoclonal antibodies.

Abstract

Antikörper sind Glykoproteine, die von ausdifferenzierten B-Zellen, den Plasmazellen, produziert werden. Sie sind zentraler Bestandteil des adaptiven Immunsystems, indem sie eingedrungene Erreger binden und somit zu deren Beseitigung führen. Außerdem werden sie als monoklonale Antikörper zur Behandlung vieler Krankheiten, wie etwa Krebs und Autoimmunerkrankungen, genutzt und daher in großen Mengen rekombinant hergestellt. Andererseits können Antikörper auch in Form von Autoantikörpern zur Entstehung von Krankheiten führen und diese aufrecht erhalten. All diese Prozesse, die durch die Bindung von Antikörpern ausgelöst werden, erfordern eine funktionierende, dreidimensionale Struktur des Antikörpers, die unter Zuhilfenahme von Chaperonen und Faltungskatalysatoren im endoplasmatischen Retikulum (ER) entsteht. Daher ist ein tiefgreifendes Verständnis von Antikörperfaltung nicht nur wesentlich, um neue Erkenntnisse zum Immunsystem zu gewinnen, sondern kann auch die rekombinante Herstellung monoklonaler Antikörper verbessern sowie dazu beitragen, neue Strategien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu gewinnen. Bislang ist der Vorgang der Antikörperfaltung jedoch unzureichend dargestellt worden. In dieser Arbeit wurde die Expression, Lokalisation, Regulation sowie Funktion von FKBP11, einer Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase (PPIase), im Hinblick auf eine mögliche Funktion als antikörperfaltendes Enzym analysiert. Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) gehört zu den interstitiellen Lungenerkrankungen (ILDs) und hat eine schlechte Prognose mit einer mittleren Überlebenszeit von 3-5 Jahren bei Diagnosestellung. Die Inzidenz der IPF ist weltweit steigend. Die Krankheit ist gekennzeichnet durch eine zunehmende Vernarbung (Fibrosierung) des Lungengewebes, die durch eine enorme Ablagerung von extrazellulärer Matrix (ECM) gekennzeichnet ist. Dies führt zu einer zunehmenden Zerstörung der Lungenarchitektur, die am Ende zum Tod der Patienten führt. Die derzeit von der Arzneimittelzulassungsbehörde der USA (Food and Drug Administration, FDA) zugelassenen, anti-fibrotischen Medikamente, namentlich Pirfenidon und Nintedanib, verlangsamen lediglich das Voranschreiten der Erkrankung, verhindern es jedoch nicht. Dies verdeutlicht, dass ein besseres Verständnis der IPF notwendig ist, um neue Behandlungsansätze zu identifizieren. Weiterhin wird zunehmend ersichtlich, dass Eigenschaften von Autoimmunerkrankungen in der IPF zu finden sind, wie etwa lymphozytäre Infiltrate in den Lungen der Patienten sowie zirkulierende Autoantikörper im Serum der Patienten. Eine bessere Charakterisierung dieser autoimmunen Eigenschaften in der IPF könnte dazu führen, neue Behandlungsansätze zu verwirklichen. Übereinstimmend mit einer vorhergehenden Proteomikstudie der IPF zeigten Lungengewebeproben von IPF-Patienten höhere Proteinmengen von FKBP11. In der Immunfluoreszenz war ersichtlich, dass FKBP11 in IPF Lungen ausschließlich von Plasmazellen (CD27+/CD38+/CD138+/CD3-/CD20-/CD45-) exprimiert wird. Entsprechend war die Zahl der Plasmazellen in IPF-Lungen deutlich erhöht. Damit übereinstimmend führte eine in vitro Plasmazelldifferenzierung mithilfe von Interleukin-2 (IL-2) und R848 (Resiquimod) zu einer Hochregulierung von FKBP11. Eine künstliche Herbeiführung von ER-Stress mittels Tunicamycin in zwei unabhängigen Zelllinien führte zur Hochregulierung der ungefalteten Protein-Antwort (UPR) und zeigte auf, dass FKBP11 als Teil der UPR in der Plasmazelldifferenzierung hochreguliert wird. Genauer noch bestätigte der vorhergehende Knockdown von XBP1, einem wichtigen Transkriptionsfaktor der Plasmazelldifferenzierung, dass die Hochregulierung von FKBP11 über XBP1 vermittelt wird. Weiterhin zeigte sich bei Herbeiführung von ER-Stress nach vorhergehendem Knockdown von FKBP11 eine erhöhte Empfindlichkeit der Zellen gegenüber ER-Stress-induziertem Zelltod. Letztlich konnte durch ein in vitro Antikörperfaltungssystem demonstriert werden, dass rekombinantes, humanes FKBP11 die Fähigkeit besitzt, Antikörper in vitro zu falten, da es sowohl den Faltungsprozess selbst beschleunigte, als auch den Ertrag an korrekt gefalteten Antikörpern steigerte. Diese Effekte konnten durch vorhergehende Inkubation von FKBP11 mit Tacrolimus (FK506) verhindert werden. Damit übereinstimmend führte ein Knockdown von FKBP11 in einer antikörperproduzierenden Hybridomzelllinie zu geringeren Antikörperkonzentrationen im Zellkulturüberstand. Abschließend lässt sich sagen, dass mit FKBP11 ein neuartiges Protein identifiziert wurde, das in der Lage ist, Antikörper in Plasmazellen zu falten. Dies gewährt neuartige Einblicke in die Biologie der Plasmazelle sowie den Prozess der Antikörperfaltung, und unterstützt weiterhin die Rolle von Autoimmunität in der IPF. Dies ermöglicht die Entwicklung neuartiger Therapieansätze, sowohl in der Behandlung der IPF, als auch in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Darüber hinaus können diese Erkenntnisse dazu beitragen, die Herstellung rekombinanter, monoklonaler Antikörper zu verbessern.