Regulation of mitochondrial DNA replication by macroD1 and ADP-ribosylation

Söllner, Flavia (2021): Regulation of mitochondrial DNA replication by macroD1 and ADP-ribosylation. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Mammalian mitochondria, the double-membrane-bound organelles found in most eukaryotic cells contain between 100 and several 100000 copies of mitochondrial DNA (mtDNA). Human mtDNA spans 16569 base pairs and codes for 37 genes: 13 protein coding, 2 rRNAs and 22 tRNAs. Both rRNAs and tRNAs are required for the synthesis of mitochondrially encoded proteins, which are all vital subunits of the electron transport chain. Hence, the maintenance and regulation of the mitochondrial genome is essential for normal cellular function and metabolism. Transcription and replication of mtDNA is constant, simultaneous and uncoupled from the progression of the cell cycle. The proteins involved in the replication and repair of mtDNA are encoded in the nucleus and shuttled into mitochondria. Dysregulation of the mitochondrial genome is implicated in a variety of neurological diseases and mitochondrial myopathies. The aetiologies behind these diseases are often either mutations in the mitochondrial genome, or mutations of the nuclear genome sequences coding for factors involved in the maintenance of mtDNA. The regulation of replication, and thereby of copy number, can be modulated and controlled at various points; at mtDNA accessibility, at transcription initiation, and at the switch between transcription initiation and replication. The transcription-initiation machinery for mtDNA consists of: POLRMT, TFB2M and TFAM; the core replication factors are: POLG1, POLG2, POLRMT, TWINKLE, LIG3, mtSSB, and topoisomerases. How the interplay between transcription initiation, transcription and replication is organized, modulated and regulated however, is largely unknown. ADP-ribosylation is a post-translational modification (PTM) heavily involved in the maintenance of the nuclear genome, but whether it is implicated in mtDNA homeostasis has not been thoroughly elucidated. Research into mtDNA homeostasis, replication and regulation is limited by a lack in DNA methodologies focused on the DNA within mitochondria, instead of in the nucleus. Further, very little is known about which mitochondrial factors are ADP-ribosylated and how this modification affects mitochondrial biology. In this thesis I have i) developed and tested a novel fluorescence-based assay to monitor mitochondrial DNA replication in cellulo and ii) investigated ADP-ribosylation in the context of MacroD1, a mitochondrial ADP-binding protein, in relation to mtDNA homeostasis.

Abstract

Säugetier-Mitochondrien, die doppelmembrangebundenen Organellen, die in den meisten eukaryotischen Zellen gefunden werden, enthalten zwischen hundert und mehreren hunderttausend Kopien mitochondrialer DNA (mtDNA). Die humane mtDNA umfasst 16569 Basenpaare und kodiert 37 Gene: 13 Proteinkodierungen, 2 rRNAs und 22 tRNAs. Sowohl rRNA als auch tRNA werden für die Synthese von mitochondrial kodierten Proteinen, die alle lebenswichtige Untereinheiten der Elektronentransportkette sind, benötigt. Daher ist die Aufrechterhaltung und Regulation des mitochondrialen Genoms für die normale Zellfunktion sowie den Stoffwechsel von wesentlicher Bedeutung. Die Transkription und Replikation von mtDNA ist konstant, zeitgleich und vom Fortschreiten des Zellzyklus entkoppelt. Die an der Replikation und Reparatur von mtDNA beteiligten Proteine werden im Kern kodiert und in die Mitochondrien transportiert. Eine Dysregulation des mitochondrialen Genoms ist an einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen und mitochondrialen Myopathien beteiligt. Die Ursachen für diese Krankheiten sind häufig entweder Mutationen im mitochondrialen Genom oder Mutationen der Kerngenomsequenzen, die für Faktoren kodieren, welche an der Aufrechterhaltung der mtDNA beteiligt sind. Die Regulierung der Replikation, und damit der Kopienzahl, kann an verschiedenen Punkten moduliert und gesteuert werden; über die Zugänglichkeit der mtDNA, bei Transkriptionsinitiierung und beim Wechsel zwischen Transkriptionsinitiierung und Replikation. Die Transkriptionsinitiationsmaschinerie für mtDNA besteht aus POLRMT, TFB2M und TFAM, die Kernreplikationsfaktoren sind POLG1, POLG2, POLRMT, TWINKLE, LIG3, mtSSB und Topoisomerasen. Wie das Zusammenspiel von Transkriptionsinitiierung, Transkription und Replikation organisiert, moduliert und reguliert wird, ist jedoch weitgehend unbekannt. Die ADP-Ribosylierung ist eine posttranslationale Modifikation (PTM), die stark an der Aufrechterhaltung des Kerngenoms beteiligt ist. Ob sie jedoch an der mtDNA-Homöostase beteiligt ist, ist noch nicht ausreichend geklärt. Die Erforschung der mtDNA-Homöostase, -Replikation und -Regulierung ist durch einen Mangel an Methoden begrenzt, die sich auf die DNA in den Mitochondrien anstatt im Kern konzentrieren. Bislang ist sehr wenig darüber bekannt, welche mitochondrialen Faktoren ADP-ribosyliert sind und wie diese Modifikation die mitochondriale Biologie beeinflusst. In dieser Arbeit habe ich i) ein neuartiges fluoreszenzbasiertes Verfahren zur Überwachung der mitochondrialen DNA-Replikation in cellulo entwickelt und getestet sowie ii) die ADP-Ribosylierung im Zusammenhang mit MacroD1, einem mitochondrialen ADP-bindenden Protein, in Bezug auf die mtDNA-Homöostase erforscht.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 17. September 2021
• 1. Bericht­erstatter:in: Ladurner, Andreas