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Efficiency and safety of gene editing in pigs: Evaluated in an experimental and in a disease relevant model
Efficiency and safety of gene editing in pigs: Evaluated in an experimental and in a disease relevant model
In this thesis, the feasibility, efficiency, and safety of gene editing technology were analysed in the pig. Gene editing has the potential to complement traditional breeding techniques and help improve animal health and welfare. However, concerns regarding the safety of this new technology prevent its application outside of research. Because pigs are physiologically very similar to humans and play an important role in agriculture, they are a suitable model to analyse the potential and risks of gene editing for applications in agriculture and potential therapeutic applications in patients. In this study the FUT1 gene which mediates resistance to Oedema disease was edited in vitro in somatic cells and in vivo in porcine embryos. The desired base specific G>A nucleotide exchange at position 307 was performed precisely and efficiently using CRISPR/Cas9 expression vectors in combination with ssDNA repair templates. The generation of OD resistant animals by GE was not planned within the scope of this project. The second part of this project focused on the investigation of off-target mutations caused by CRISPR/Cas9 technology, the most widely used GE tool. One blastomere of porcine two-cell-stage embryos was microinjected with CRISPR/Cas9 expression vectors to generate mosaic foetuses. The edited and non-edited cell populations from two mosaic foetuses were separated and analysed by whole genome sequencing. This approach facilitates the differentiation between natural mutations that occur during embryogenesis and off-target mutations caused by gene editing technology. The frequency of SNVs in embryos edited by CRISPR/Cas9 was higher than expected but within the spontaneous mutation rate. Because none of the mutations aligned with the predicted off-target sites they are likely artefacts caused by PCR amplification during library generation. A more precise evaluation of off-target mutations could be obtained by avoiding the cell culture step and by utilising PCR-free Next Generation Sequencing technology. Cells from the same embryo are the best possible control group but a final distinction between off-target effects and natural mutations remains difficult because even these have certain genomic differences., In dieser Arbeit wurde die Machbarkeit, Effizienz und Sicherheit der Genom-Editierung beim Schwein analysiert. Genom Editierung könnte in Zukunft traditionelle Züchtungsmethoden ergänzen und somit zur Verbesserung der Tiergesundheit und des Tierwohls beitragen. Allerdings verhindern Zweifel bezüglich der Sicherheit dieser neuen Technologie ihre Anwendung außerhalb der Forschung. Schweine sind Menschen physiologisch sehr ähnlich und spielen eine wichtige Rolle in der Landwirtschaft. Deshalb sind sie ein geeignetes Model, um die potenziellen Risiken der Genom-Editierung vor einer möglichen Anwendung in der Landwirtschaft oder Humanmedizin zu erforschen. Hier wurde das FUT1 Gen, welches die Resistenz gegenüber der Ödemkrankheit vermittelt in vitro in somatischen Zellen und in vivo in Schweine Embryos editiert. Der erwünschte G>A Basenaustausch an Position 307 konnte präzise und effizient durchgeführt werden. Hierzu wurden CRISPR/Cas9 Expressionsvektoren in Verbindung mit einzelsträngigen DNA-Reparaturvorlagen verwendet. Die Generierung gegen Ödemkrankheit resistenter Tiere mittels Genom-Editierung war im Rahmen dieses Projektes nicht vorgesehen. Der zweite Teil dieses Projektes beschreibt die Erforschung von Off-Target Mutationen durch CRISPR/Cas9, das am häufigsten Verwendete Werkzeug für die Genom-Editierung. Eine Blastomere eines Zwei-Zell Embryos wurde mit CRISPR/Cas9 Expressionsvektoren mikroinjiziert, um mosaike Föten zu erzeugen. Die editierten und nicht editierten Zellpopulationen wurden separiert und durch Sequenzierung des gesamten Genoms analysiert. Diese Vorgehensweise erlaubt eine Abgrenzung zwischen natürlichen Mutationen, welche während der Embryogenese entstehen und jenen, welche durch die Genom-Editierung verursacht werden. Die Rate an Polymorphismen in den editierten Embryos war höher als erwartet, lag aber innerhalb der spontanen Mutationsrate. Keine der Mutationen stimmte mit den vorhergesagten off-target Sequenzen überein. Vermutlich handelte es sich hierbei um Artefakte, welche durch die PCR Amplifikation zur Erstellung der Sequenzierungsbibliothek verursacht wurden. Eine präzisere Evaluierung von Off-Target Mutationen könnte in Zukunft durch Vermeidung des Zellkultur Schrittes und durch Verwendung PCR-freier Sequenzierungstechnologie erreicht werden. Zellen vom selben Embryo stellen die bestmögliche Kontrollgruppe dar, doch selbst diese weisen gewisse genomische Unterschiede auf. Deshalb bleibt eine klare Abgrenzung zwischen natürlichen und off-target Mutationen schwierig.
Genome engineering, CRISPR/Cas, Off-Target Mutations, Oedema Disease
Klinger, Bernhard
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Klinger, Bernhard (2021): Efficiency and safety of gene editing in pigs: Evaluated in an experimental and in a disease relevant model. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

In this thesis, the feasibility, efficiency, and safety of gene editing technology were analysed in the pig. Gene editing has the potential to complement traditional breeding techniques and help improve animal health and welfare. However, concerns regarding the safety of this new technology prevent its application outside of research. Because pigs are physiologically very similar to humans and play an important role in agriculture, they are a suitable model to analyse the potential and risks of gene editing for applications in agriculture and potential therapeutic applications in patients. In this study the FUT1 gene which mediates resistance to Oedema disease was edited in vitro in somatic cells and in vivo in porcine embryos. The desired base specific G>A nucleotide exchange at position 307 was performed precisely and efficiently using CRISPR/Cas9 expression vectors in combination with ssDNA repair templates. The generation of OD resistant animals by GE was not planned within the scope of this project. The second part of this project focused on the investigation of off-target mutations caused by CRISPR/Cas9 technology, the most widely used GE tool. One blastomere of porcine two-cell-stage embryos was microinjected with CRISPR/Cas9 expression vectors to generate mosaic foetuses. The edited and non-edited cell populations from two mosaic foetuses were separated and analysed by whole genome sequencing. This approach facilitates the differentiation between natural mutations that occur during embryogenesis and off-target mutations caused by gene editing technology. The frequency of SNVs in embryos edited by CRISPR/Cas9 was higher than expected but within the spontaneous mutation rate. Because none of the mutations aligned with the predicted off-target sites they are likely artefacts caused by PCR amplification during library generation. A more precise evaluation of off-target mutations could be obtained by avoiding the cell culture step and by utilising PCR-free Next Generation Sequencing technology. Cells from the same embryo are the best possible control group but a final distinction between off-target effects and natural mutations remains difficult because even these have certain genomic differences.

Abstract

In dieser Arbeit wurde die Machbarkeit, Effizienz und Sicherheit der Genom-Editierung beim Schwein analysiert. Genom Editierung könnte in Zukunft traditionelle Züchtungsmethoden ergänzen und somit zur Verbesserung der Tiergesundheit und des Tierwohls beitragen. Allerdings verhindern Zweifel bezüglich der Sicherheit dieser neuen Technologie ihre Anwendung außerhalb der Forschung. Schweine sind Menschen physiologisch sehr ähnlich und spielen eine wichtige Rolle in der Landwirtschaft. Deshalb sind sie ein geeignetes Model, um die potenziellen Risiken der Genom-Editierung vor einer möglichen Anwendung in der Landwirtschaft oder Humanmedizin zu erforschen. Hier wurde das FUT1 Gen, welches die Resistenz gegenüber der Ödemkrankheit vermittelt in vitro in somatischen Zellen und in vivo in Schweine Embryos editiert. Der erwünschte G>A Basenaustausch an Position 307 konnte präzise und effizient durchgeführt werden. Hierzu wurden CRISPR/Cas9 Expressionsvektoren in Verbindung mit einzelsträngigen DNA-Reparaturvorlagen verwendet. Die Generierung gegen Ödemkrankheit resistenter Tiere mittels Genom-Editierung war im Rahmen dieses Projektes nicht vorgesehen. Der zweite Teil dieses Projektes beschreibt die Erforschung von Off-Target Mutationen durch CRISPR/Cas9, das am häufigsten Verwendete Werkzeug für die Genom-Editierung. Eine Blastomere eines Zwei-Zell Embryos wurde mit CRISPR/Cas9 Expressionsvektoren mikroinjiziert, um mosaike Föten zu erzeugen. Die editierten und nicht editierten Zellpopulationen wurden separiert und durch Sequenzierung des gesamten Genoms analysiert. Diese Vorgehensweise erlaubt eine Abgrenzung zwischen natürlichen Mutationen, welche während der Embryogenese entstehen und jenen, welche durch die Genom-Editierung verursacht werden. Die Rate an Polymorphismen in den editierten Embryos war höher als erwartet, lag aber innerhalb der spontanen Mutationsrate. Keine der Mutationen stimmte mit den vorhergesagten off-target Sequenzen überein. Vermutlich handelte es sich hierbei um Artefakte, welche durch die PCR Amplifikation zur Erstellung der Sequenzierungsbibliothek verursacht wurden. Eine präzisere Evaluierung von Off-Target Mutationen könnte in Zukunft durch Vermeidung des Zellkultur Schrittes und durch Verwendung PCR-freier Sequenzierungstechnologie erreicht werden. Zellen vom selben Embryo stellen die bestmögliche Kontrollgruppe dar, doch selbst diese weisen gewisse genomische Unterschiede auf. Deshalb bleibt eine klare Abgrenzung zwischen natürlichen und off-target Mutationen schwierig.