Targeting the residual progression of chronic kidney disease with type-2 diabetes beyond the renoprotective effects of a metformin-ramipril-empagliflozin combination

Motrapu, Manga (2021): Targeting the residual progression of chronic kidney disease with type-2 diabetes beyond the renoprotective effects of a metformin-ramipril-empagliflozin combination. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Adipositas-assoziierter Typ-2-Diabetes (T2D) ist eines der größten Gesundheitsprobleme der Welt. Die Morbidität und Mortalität von T2D sind mit Komplikationen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, chronischer Nierenerkrankung (CKD), diabetischer Retinopathie und diabetischem Fußsyndrom assoziiert. Risikofaktoren für T2D sind ein bewegungsarmer Lebensstil, hyperkalorische Ernährung, Adipositas, Hyperlipidämie und Hyperurikämie. Diabetes führt zu hämodynamischen und metabolischen Stress in der Niere. Der zugrundeliegende Pathomechanismus beruht auf glomerulärer Hyperfiltration und einer Hyperreabsorption. Reaktiv kommt es zu einer Hyperreabsorption löslicher Substanzen im proximalen Tubulus. Dieser „Stress“ stellt eine funktionelle Überlastung der Nierennephrone dar und begünstigt das Auftreten und Fortschreiten von Nierenerkrankungen. Insbesondere Patienten mit einer vorbestehenden, verringerten Nephronenanzahl sind gefährdet. Therapeutisch werden standardmäßig Medikamente zur Senkung des Blutzuckerspiegels (Inhibitoren des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS), Metformin, Inhibitoren des Natrium-Glucose-Transporters-2 (SGLT2) und des Blutdrucks (Erstlinien Therapie mit Inhibitoren des RAAS, sekundäre Therapie mit Statinen sowie Nikotinentwöhnung und salzarme Ernährung) eingesetzt. Oftmals reicht eine Standardtherapie zur Prävention der Progression der Nierenerkrankung und Verbesserung der Prognose nicht aus. Auch unser Verständnis für die zugrundeliegenden Pathomechanismen entwickelt sich weiter. Als Reaktion hierauf muss die Standardtherapie stetig verbessert und angepasst werden. Jüngste Studien legen nahe, dass beispielsweise eine verbesserte Podozytenregeneration (mit Hilfe von Arzneimitteln wie BIO) ein potenzieller therapeutischer Ansatzpunkt zur Milderung von Hyperfiltration und Albuminurie sein könnte. Die Frühphase der CKD ist durch eine stabile Gesamt-GFR, mesangiale Glomerulosklerose und milde Albuminurie gekennzeichnet. Dies ist mit einem CKD-Stadium G1A1 (GFR> = 90 ml/min/1,73 m2 und ACR <3 mg/mmol) vergleichbar und wird in den meisten tierexperimentellen Studien nachgeahmt. Im Gegensatz dazu präsentieren sich Patienten mit Diabetes in klinischen Berichten mit einem Rückgang der GFR und Makroproteinurie unter Standardtherapie. Um diesen Sachverhalt im Tiermodell zu überprüfen, wurde zunächst ein Studiendesign für eine progressive Glomerulosklerose etabliert. Hierzu wurden adipöse db / db-Mäuse mit T2D eingesetzt. Der progressive GFR-Verlust konnte durch Uninephrektomie im Alter von sechs Wochen imitiert werden. Zur Aggravation der glomerulären Hyperfiltration erhielten die Tiere bis zur 20. Woche des Experiments eine salzarme Diät. Im Verlauf entwickelten die Mäuse eine Glomerulosklerose. Die Bewertung der CKD erfolgte mithilfe von Nierenfunktionsparametern wie GFR und Albuminurie. T2D-Unx Mäuse zeigten im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen (WT-Unx) während des gesamten Experiments ein erhöhtes Körpergewicht und einen erhöhten Blutzucker. Hyperfiltration und Albuminurie konnten ebenfalls nur bei T2D-Unx-Mäusen beobachtet werden. Die Auswertung immunhistochemischer Schnittpräparate ergab eine verringerte Podozytendichte und Glomerulosklerose in kortikalen und juxtamedullären Nephronen von T2D-Unx-Mäusen. Im nächsten Schritt wurde die Standardtherapie zur Behandlung des T2D auf dieses Modell angewendet. Hierzu wurde den Mäusen für vier Wochen Metformin, Ramipril und Empagliflozin (MRE) verabreicht. Die Auswertung der Daten nach der vierwöchigen Therapie ergab, dass Mäuse mit medikamentöser Behandlung eine verringerte Hyperglykämie und Albuminurie im Vergleich zur Kontrollgruppe aufwiesen. In der Sirius-Rot-Färbung war bei MRE-behandelten T2D-Unx-Mäusen eine signifikante Reduktion der Glomerulosklerose, insbesondere in juxtamedullären Nephronen, zu beobachten. Die kortikalen Nephrone der T2D-Unx-Mäusen zeichneten sich zudem durch eine verringerte Hypertrophie und signifikant verbesserte Podozytenregeneration aus. Die Filtrationsspaltdichte wurde als Prädiktor für eine ultrastrukturelle Podozytenverletzung mithilfe von STED-Hochauflösungsmikroskopie analysiert. Im Vergleich zu unbehandelten Mäusen erhöhte die MRE-Behandlung die Dichte der Filtrationsschlitze entlang der glomerulären Filtrationsbarriere. Insgesamt konnte also ein nephroprotektiver Effekt durch die vierwöchige MRE-Therapie nachgewiesen werden. Neben der üblichen Therapie konnte in diesem Modell auch das neuartige Medikament BIO untersucht werden. Hier ist insbesondere BIO zu erwähnen. Es sollte gezeigt werden, dass eine Therapie aus MRE und BIO im etablierten Tiermodell zu einem verbesserten Phänotyp führt. Hierzu wurde die Therapie aus MRE+BIO einer MRE Therapie gegenübergestellt. Interessanterweise zeigte die Kombinationstherapie eine verringerte ΔGFR im Vergleich zur alleinigen MRE Therapie. Die Glomerulosklerose war insbesondere in juxtamedullären Nephronen von T2D-Unx-Mäusen (MRE+BIO) signifikant reduziert. Darüber hinaus zeigte die MRE+BIO-Behandlung eine signifikante Verbesserung der glomerulären Hyppertrophie sowie Podozytenregeneration in juxtamedullären Nephronen von T2D-Unx-Mäusen. Die MRE+BIO-Behandlung verbesserte die Filtrationsspaltdichte der Podozyten entlang der glomerulären Filtrationsbarriere. Weiterhin wurden T2D-Unx-Mäuse mit einer BIO Monotherapie Mäusen mit Kombinationstherapie aus MRE+BIO gegenübergestellt. Im Rahmen der Monotherapie konnte eine signifikante Reduktion der GFR beobachtet werden. Ebenfalls wirkte sich die Monotherapie im Vergleich zur Kombinationstherapie nicht negativ auf die sekundären Parameter aus. Zwar reduzierte die BIO-Behandlung signifikant die Glomerulosklerose, hatte jedoch im Vergleich zur MRE+BIO-Behandlung keinen Einfluss auf die Podozytenzahl. Insgesamt kann einer BIO-Supplementierung zu einer MRE Behandlung ein nephroprotektiver Effekt zugeschrieben werden. Dieser Effekt wurde auch in vitro untersucht. Dazu wurden Glomeruli in hoher Reinheit aus Mäusenieren extrahiert. In Anwesenheit hoher Glukose (30 mmol) und BIO wurde die mRNA-Expression des Podozyten-spezifischen Proteins Nephrin untersucht. Als Kontrolle dienten Kulturbedingungen ohne Glukose. Nephrin wurde vor allem von Zellen unter BIO-Exposition vermehrt exprimiert. Insgesamt erwies sich BIO als ein potenter Nephrin-Protein-Induktor in Maus-Glomeruli unter diabetischen und nicht-diabetischen Bedingungen. Das Ergebnis unserer Experimente zur Weiterentwicklung der Standardtherapie der progressiven CKD unter T2D kombinierte ein Modell aus: progressivem Nephronenverlust, Standard-Komedikation, Berechnung der Gruppengröße, Durchführung einer neuartigen Therapie, vorab festgelegter primärer und sekundärer Endpunkte (orientiert an klinischen Studien), komplexe morphologische Untersuchungen, um mechanistische Erkenntnisse zu gewinnen. Unser neuartiges BIO-Medikament zeigte in diesem experimentellen Design eine signifikante, nephroprotektive Wirkung gegenüber Metformin mit doppelter RAAS / SGLT2-Inhibition. Die Zahl der Podozyten und die morphologischen Veränderungen der Nieren nahmen unter Verbesserung der mutmaßlichen Wirkmechanismen zu. Abschließend legte der Wirkmechanismus der Medikamente eine doppelte RAAS / SGLT2-Hemmung nahe. Hiervon könnten insbesondere T2D Patienten mit einer CKD-Progression profitieren.

Abstract

Obesity-associated type-2 diabetes (T2D) is a leading worldwide medical concern. The morbidity and mortality of T2D links tightly to complications such as cardiovascular disease, chronic kidney disease (CKD), blindness, and foot ulcers. Risk factors for T2D include a sedentary lifestyle, hypercaloric diet, obesity, hyperlipidemia, and hyperuricemia. The diabetes mechanism leading to kidney injury involves glomerular hyperfiltration, and the associated hyperreabsorption of solutes in the proximal tubule is referred to as hemodynamic and metabolic stress for the kidney. This “stress” represents a functional overload to the kidney nephrons, a risk factor for kidney disease onset and progression, especially in patients with low nephron numbers. The current standard medical therapy is limited to the control of hyperglycemia (renin-angiotensin system (RAS) inhibitors, metformin, sodium-glucose transporter-2 (SGLT2) inhibitor) and blood pressure control, preferentially with inhibitors of the RAS as well as adjunct treatments such as statins, smoking cessation, and low-salt diet. However, the mentioned strategies are not sufficient to delay the progression of CKD in most cases. Furthermore, we need to improve potential medication for diabetic patients. Recent studies suggest that enhancing podocyte regeneration (using drugs such as BIO) could be a potential therapeutic strategy to attenuate hyperfiltration and albuminuria. The initial CKD phase, characterized by stable total glomerular filtration rate (GFR), mesangial glomerulosclerosis, and mild albuminuria similar to CKD stage G1A1 (GFR>= 90 ml/min/1.73 m2 and ACR < 3 mg/mmol), is mimic by most animal studies in this domain. Conversely, most clinical reports associate diabetes patients with gradual GFR decline and macroproteinuria under standard-of-care treatment. Furthermore, novel drugs can be studied in an experimental setting of obese db/db mice with T2D with residual progressive GFR loss by induction of uninephrectomy despite antidiabetic therapy and combination therapy RAS/ SGLT2 inhibitors. Therefore, BIO was hypothesized to decrease CKD progression over metformin, ramipril, and empagliflozin (MRE) therapy in uninephroctomized obese db/db mice with T2D (T2D-Unx). A progressive glomerulosclerosis mouse model was developed by induction of uninephrectomy (at six weeks of age) in obese db/db mice with T2D, after uninephrectomy, fed with the low salt diet until week 20 of the experiment to accelerated glomerular hyperfiltration-related CKD progression. CKD was evaluated by kidney function parameters such as GFR and albuminuria. T2D-Unx showed mice increased body weight and blood glucose throughout the experiment compared with wild type controls (WT-Unx). Furthermore, T2D-Unx mice showed hyperfiltration and albuminuria compared with WT-Unx mice. Immunohistochemical analysis revealed reduced podocyte density and increased glomerulosclerosis in cortical and juxtamedullary nephrons of T2D-Unx mice. These results suggest our model resembles the mouse model with progressive glomerulosclerosis. After establishing a progressive glomerulosclerosis mouse model, four weeks of diabetic patients treat standard-of-care drugs such as metformin, ramipril, and empagliflozin (MRE). Four weeks of MRE treatment shown hyperglycemia and albuminuria reduction compared with untreated T2D-Unx mice. In Sirius red staining, MRE treated T2D-Unx mice significantly reduced glomerulosclerosis, especially in juxtamedullary nephrons. Furthermore, MRE treated T2D-Unx mice, reducing hypertrophy, and significantly enhanced podocyte regeneration in cortical nephrons. Filtration slit density was analysed as a predictor of ultrastructural podocyte injury by STED super-resolution microscopy on tissue clearing concerning podocyte assessment. Compared with untreated T2D-Unx mice, MRE treatment substantially increased the density of filtration slits along the glomerular filtration barrier. Therefore, four weeks of MRE therapy was shown nephroprotection in T2D-Unx mice. Further, we included a novel BIO drug to the treatment regimen along with MRE to T2D-Unx mice for four weeks. Interestingly, in the progressive glomerulosclerosis mouse model, four weeks of treatment with MRE+BIO treatment shown significantly reduced ΔGFR compared to MRE treated T2D-Unx mice. Complementation of BIO to MRE treatment significantly reduced glomerulosclerosis, especially in juxtamedullary nephrons in T2D-Unx mice. Furthermore, MRE+BIO treatment represented a significant reduction of hypertrophy and enhanced podocyte regeneration in juxtamedullary nephrons in T2D-Unx mice. MRE+BIO treatment substantially improved podocyte filtration silt density along the glomerular filtration barrier correlated to MRE treated T2D-Unx mice. Finally, BIO alone treated T2D-Unx mice affected the kidney compared with BIO add on treatment with MRE. In T2D-Unx mice, the administration of Bio (without MRE therapy) significantly reduced GFR decline and did not affect secondary outcomes due to MRE therapy's absence. However, BIO treatment could significantly decrease glomerulosclerosis, with no effect on podocyte numbers compared with MRE+BIO treatment. From the above observation, BIO supplementation, along with MRE therapy, can improve kidney protection during disease conditions. Furthermore, we investigated its direct impact on whole mouse glomerular cells in vitro. For that, glomeruli were extracted at high purity from mouse kidneys. In the presence of high glucose (30 Mm), the mRNA expression of the podocyte-specific protein, i.e., nephrin, is highly expressed within glomeruli under the glucose condition control group treated with BIO and quantified. Therefore, BIO is a particular nephrin protein inducer in mouse glomeruli in non-diabetic and diabetic conditions. The outcome in our experiments to advance drug testing for progressive CKD with T2D combined a model of progressive nephron loss, standard co-medication, group size calculation, randomization to an intervention not approved before disease, pre-specified primary and secondary endpoints similar to those used in clinical trials, complex morphologic estimation to obtain mechanistic insights and detailed safety analysis. Our novel BIO drug demonstrated significant nephroprotective effects over metformin with dual RAS/ SGLT2 inhibition in this experimental setting. Podocyte numbers and kidney morphological changes were increased as the putative mechanism of action was improved. Furthermore, drug targeting in these mechanisms can consider dual RAS/SGLT2 inhibition and be a beneficial add-on medication strategy in patients with gradual CKD progression with diabetes.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Type 2 diabetes, Kidney pathophysiology, CKD, Hypertrophy, Hyperfiltration, Podocyte regeneration, BIO, kidney progenitor cells
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 29. Juli 2021
• 1. Bericht­erstatter:in: Anders, Hans-Joachim