Regulation des Calciumsignals G-Protein-gekoppelter Rezeptoren durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen

Deininger, Matthias Manfred (2021): Regulation des Calciumsignals G-Protein-gekoppelter Rezeptoren durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Signaltransduktion über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) ist ein zentraler Mechanismus des interzellulären Informationstransfers. Die Aktivierung einiger GPCRs führt Gαq-vermittelt unter anderem zur intrazellulären Freisetzung des second messengers Calcium und zur Aktivierung von ERK1/2. Diese Signalkaskaden setzen sich fort, bis eine Rezeptorinaktivierung erfolgt. Demnach ist die Signalinaktivierung von entscheidender Bedeutung für die zelluläre Integrität und Funktion. G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) gelten als wichtige Regulatoren des GPCR-vermittelten Signals. Insgesamt wurden fünf nicht-visuelle GRKs (GRK2-6) identifiziert, die jeweils aus drei Domänen bestehen. Allen GRKs gemein ist die Funktion aktivierte Rezeptoren zu phosphorylieren und dadurch die Rezeptorbindung von β-Arrestinen zu initialisieren. GRK2 und GRK3 können überdies die aktivierten G-Proteine Gαq respektive Gβγ binden und dadurch zum Prozess der Signalinaktivierung beitragen. Ein tieferes Verständnis der zugrundeliegenden GRK-Regulationsmechanismen fehlt bisher. Dieses ist jedoch unabdingbare Grundlage, um die Bedeutung einer GRK-Dysregulation für Krankheiten abzuschätzen, potenzielle pharmakologische Zielstrukturen zu identifizieren und die Frage zu beantworten, wie die nur fünf GRKs mit hunderten Rezeptoren regulierend interagieren und welche GRK-Domänen dabei wichtig sind. Ziel dieser Doktorarbeit ist es daher, die funktionelle Bedeutung der einzelnen GRK-Domänen für die Rezeptorsignalregulation zu quantifizieren und für ausgewählte GPCRs zu vergleichen. Hierzu wurden vier Gαq-gekoppelte Rezeptoren, die Bradykinin B1 und B2 Rezeptoren sowie die Protease-aktivierten Rezeptoren 1 und 2 (PAR1 und PAR2) ausgewählt. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Calciumfreisetzung nach Rezeptoraktivierung in Abhängigkeit von überexprimierten GRKs gemessen. Im zweiten Teil wurde die Bedeutung der GRKs für nachgeordnete Signalregulatoren wie β-Arrestine und p-ERK1/2 exemplarisch an den Bradykininrezeptoren untersucht. Die intrazelluläre Calciumkonzentration wurde im ersten Teil mittels Fluoreszenzmessungen in HEK-293-Zellen bestimmt. Die untersuchten GRKs wurden zur Abgrenzung gegen endogene Effekte überexprimiert. Dies ließ Rückschlüsse auf den Einfluss dieser GRKs respektive der GRK-Mutanten für die Rezeptorsignalinaktivierung zu. GRK-Mutanten wurden eingesetzt, um selektiv die Relevanz einzelner GRK-Domänen beurteilen zu können. GRK2 und 3 zeigten für die Bradykininrezeptoren eine Kinase-unabhängige, für die Protease-aktivierten Rezeptoren jedoch eine Kinase-abhängige Regulation des Caliumsignals. Für GRK4-6 konnte bei allen untersuchten Rezeptoren eine funktionelle Abhängigkeit von der GRK-Kinasefunktion nachgewiesen werden. Die Gαq-Bindung an die N-terminale Domäne von GRK2 und 3 war bei beiden Bradykininrezeptoren funktionell essentiell, bei PAR1 von Bedeutung und bei PAR2 ohne Effekt für die GRK-Calciumsignalregulation. Bei allen vier Rezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Gβγ-Bindung an die C-terminale GRK-Domäne elementar für die GRK-Funktion ist. In Zusammenschau mit anderen Veröffentlichungen unterstützen diese Daten das Modell, dass GRK2 und GRK3 durch Bindung freier Gβγ-Untereinheiten an den aktivierten Rezeptor rekrutiert werden und sodann in Abhängigkeit vom aktivierten Rezeptor entweder die GRK-Kinase oder die Gαq-Bindungsfähigkeit funktionell wichtiger ist. Untersuchungen in dieser Arbeit mittels GRK-Doppelmutanten, mit nur einer verbleibenden funktionsfähigen Domäne, wiesen überdies auf synergistische Mechanismen der beiden letztgenannten GRK-Domänen hin, welche sich unter anderem durch Intra-GRK-Interaktionen erklären ließen. Starke Unterschiede bezüglich der Regulation durch GRK4-6 zwischen den Rezeptorpaaren weisen außerdem darauf hin, dass GRK-Affinitätsunterschiede für verschiedene GPCRs existieren. Die Messungen des zweiten Teils, welche den Einfluss der GRK2-Familie auf p-ERK1/2 nach Rezeptoraktivierung quantifizierten, wurden mittels Immun-Sandwich-Assay durchgeführt. Die Resultate bestätigten überwiegend die Relevanz der GRK-Domänen, wie bereits für Calcium beschrieben. Die Bedeutung der GRK-Überexpression für die β-Arrestin-Rezeptorrekrutierung wurde mittels Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, entgegen einer erwarteten Rezeptor-Arrestin-Bindungssteigerung, für GRK2-5 keinerlei oder geringe Veränderungen und für GRK6 eine Kinase-abhängige BRET-Signalreduktion. Insgesamt belegen die Untersuchungen dieser Arbeit, dass die Bedeutung der GRKs und ihrer Funktionsdomänen für die Rezeptorregulation des Calciumsignals neben der GRK-Familie primär durch die jeweiligen aktivierten Rezeptoren beeinflusst wird. Die Ergebnisse des zweiten Abschnitts illustrieren, dass die Regulation nachrangiger, zellulärer Proteine durch GRKs bisher unzureichend verstanden ist. Es müssen weitere Untersuchungen folgen, bevor zukünftig eine zielgerichtete Therapie, beispielsweise durch spezifische Beeinflussung der GRK-GPCR-Regulation eines ausgewählten Rezeptors, unter Abwägung der Risiken und Nebenwirkungen erfolgen kann.

Abstract

Signal transduction via G protein-coupled receptors (GPCR) is a central mechanism of intercellular information transfer. The activation of some GPCRs results, inter alia, in a Gαq mediated intracellular release of second messenger calcium and activation of ERK1/2. These signal cascades continue until the receptor is deactivated. Thus, signal inactivation is crucial to preserve cellular integrity, function and prevent cellular dysregulation or damage. G protein-coupled receptor kinases (GRKs) are classified as important regulators of the GPCR-mediated signalling. A total of five non-visual GRKs (GRK2-6) were identified, each consisting of three domains. Common to all GRKs is the function of phosphorylating activated receptors and thus initialising the receptor binding of β-arrestins. GRK2 and 3 may additionally bind activated G-proteins Gαq and Gβγ and thus contribute to signal inactivation. Nevertheless, a deeper understanding of the underlying mechanisms of receptor regulation via GRKs is still missing. This, however, is fundamental for understanding the relevance of the GRK dysregulation in diseases and subsequently identifying potential pharmacological target structures. It should also help answering the question of how only five non-visual GRKs take part in the regulation process of hundreds of receptors and which GRK domains are relevant in this process. The aim of this doctoral thesis is to quantify the functional relevance of different GRK domains for receptor signal regulation and to compare their impact for different GPCRs. The four Gαq-mediated receptors bradykinin B1 and B2 receptors and protease-activated receptors 1 and 2 (PAR1 and PAR2) are well suited for this goal. First, the calcium release after receptor activation was measured in relation to overexpressed GRKs. Second, the importance of GRKs for downstream signal regulators such as β-arrestin and the kinase p-ERK1/2 was measured exemplarily at bradykinin receptors. In the first section, the intracellular calcium concentration was quantified by fluorescence measurements in HEK-293 cells. The investigated GRKs were overexpressed to differentiate them from endogenous effects. This allowed drawing conclusions on the influence of these GRKs and their mutants for receptor signal inactivation. GRK mutants have been used to selectively assess the relevance of individual GRK domains. GRK2 and 3 showed a kinase-independent regulation of the calcium signal for both bradykinin receptors, but a kinase-dependent regulation for the protease-activated receptors. For GRK4-6 the functional dependence on GRK kinase activity could be demonstrated for all investigated receptors. Gαq binding to the N-terminal domain of GRK2 and 3 was functionally essential for both bradykinin-receptors, important for PAR1 and without effect for GRK calcium signal regulation of PAR2. For all four receptors the Gβγ binding to the C-terminal GRK domain was crucial for the GRK function. In consensus with other publications, these data support the model of GRK2 and 3 being recruited to the activated receptor by Gβγ binding. Subsequently, either the GRK kinase or the Gαq binding ability is functionally more important, depending on the activated receptor. Studies carried out within this thesis using GRK2 and 3 double mutants with only one functional domain remaining also indicated synergistic mechanisms of the latter two GRK domains, which could be explained, inter alia, by intra-GRK interactions. Additionally, strong differences between the pairs of receptors seen in GRK4-6 regulation allow the assumption that GRK affinity differences exist for different GPCRs. Measurements in the second section, which quantified the effect of GRK2 familiy for p-ERK1/2 generation after GPCR activation, were processed by immunosandwich assay. The results confirmed mainly the relevance of the GRK domains, as described above for calcium. The impact of GRK overexpression on β-arrestin recruitment to the activated receptor, were carried out by bioluminescence resonance energy transfer (BRET). Corresponding results showed no or minor changes for GRK2-5 after GRK overexpression, contrary to the expected increase in receptor-β-arrestin binding and BRET-signal, except for GRK6, where a GRK kinase-dependent reduction of the BRET-signal could be detected. Altogether, these investigations substantiate that the influence of GRKs and their functional domains on receptor calcium signal regulation is primarily determined by the activated receptor along with the GRK family involved. Moreover, the results of the second section illustrate that the regulation of cellular proteins downstream to receptors via GRK has so far been understood insufficiently. Thus, further investigations must follow before a targeted therapy, for example by addressing specifically the GRK-GPCR regulation of a certain receptor, can be developed in the future taking into account potential risks and side effects.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: GRK, G-Protein-gekoppleter Rezeptor, G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase, Signalinaktivierung, Calcium
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 15. Juli 2021
• 1. Bericht­erstatter:in: Faussner, Alexander