Extracellular DNA contributes to cholesterol crystal embolism-induced clot formation, acute kidney injury, and tissue infarction

Shi, Chongxu (2021): Extracellular DNA contributes to cholesterol crystal embolism-induced clot formation, acute kidney injury, and tissue infarction. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Atherosklerose ist weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Bei fortgeschrittener Atherosklerose ist die Cholesterinkristallembolie (CCE) eine potenziell lebensbedrohliche Komplikation mit einer durchschnittlichen Mortalität von 62,8%. Autopsien oder Gewebebiopsien zeigen Cholesterinkristalle (CC) im arteriellen Lumen, umgeben von einer fibrotischen Matrix, die das Gefäßlumen verschließt. Über die genauen zellulären und molekularen Mechanismen nach CCE ist wenig bekannt, was teilweise auf das Fehlen eines Tiermodells zurückzuführen ist. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die Entwicklung eines reproduzierbaren Mausmodells der CCE zur Nachahmung der morphologischen und funktionellen Eigenschaften der CCE beim Menschen dazu beitragen würde, die molekularen Mechanismen des CC-gesteuerten arteriellen Verschlusses, des Gewebeinfarkts und des Organversagens zu untersuchen. CCE wurden in C57BL/6J-Mäusen durch Injektion von CC über einen minimal- invasiven Eingriff in die linke Nierenarterie induziert. Primärer Endpunkt war die glomeruläre Filtrationsrate (GFR), die am wachen und frei beweglichen Tier gemessen wurde, um den Abfall der exkretorischen Nierenfunktion als Marker eines akuten Nierenversagens zu bestimmten. Die Größe des Niereninfarkts wurde, wie bei Myokardinfarkt oder Schlaganfallmodellen etabliert, per TTC-Färbung von Nierenschnitten und Planimetrie quantifiziert. Injektion von CC verursachte einen dosis-abhängigen Abfall der GFR und Territorialinfarkte der Niere. Ursache waren Verschlüsse präglomerulärer Arterien und Arteriolen. Der Kristallanteil am Gefäßverschluss war gering, stattdessen fanden sich Fibrin+ Thrombusmaterial um die Kristalle, die das arterielle Lumen ausfüllten. Wir nannten diese Strukturen “Kristallthrombosen”. Im Vergleich zum GFR Abfall, war das Ausmaß der Infarktgrößen variabler. 3D Rekonstruktionen von Angio-μCTs zeigte partielle und vollständige arterielle Verschlüsse und Rarefizierung der arteriellen Blutgefäße. Histologisch fand sich nach 24 h ein deutliches perilesionales Neutrophileninfiltrat. Somit imitiert unser Modell periphere CCE mit arteriellen Verschlüssen, die akute territoriale Infarkte, perilesionale Entzündung und fiunktionelles Organversagen. Das Blockieren der Nekroinflammation/Infarzierung in mixed lineage kinase domain-like (Mlkl)-defizienten Mäusen oder mit dem Inhibitor Nec-1s bzw. einem NLRP3-Inhibitor reduzierte signifikant die Infarktgröße und Infiltration von Neutrophilen im Vergleich zu Kontrollen. Keine dieser Interventionen hatte jedoch Auswirkungen auf den durch CCE verursachten GFR-Verlust (=Organversagen), weil keine der Interventionen Einfluss auf die arteriellen Verschlüsse hatte. Da in der Niere die Funktion zu allererst von der glomerulären Perfusion abhängt, verhindert die Hemmung der ischämen Nekrose alleine noch nicht das Nierenversagen. Somit war klar, dass die Kristallthrombosen das entscheidende Therapietarget bei CCE darstellen. Histologisch bestanden die Kristallthrombosen aus Erythrozyten, Plättchen, Neutrophile, Fibrin, und extrazelluläre DNA (ecDNA). Zunächst haben wir Neutrophile mit einem depletierenden Antikörper selektiv entfernt, bzw. die Bildung von neutrophil extracellular traps (NETs) mit einem Inhibitor gehemmt. Beide Interventionen verringerten die Größe des Niereninfarkts im Vergleich zur Kontrollgruppe, dies hatte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die arteriellen Verschlüsse bzw. den GFR-Verlust. Im Gegensatz dazu schützte der Thrombozyten-P2Y12-Rezeptorantagonist Clopidogrel Mäuse vollständig vor Kristallthrombosen, GFR-Abfall und Niereninfarkt. Daher sind Blutplättchen, jedoch nicht neutrophile Granulozyten, von zentraler Bedeutung für CCE-induzierte Kristallthrombosen und ihre Folgen. Als Nächstes testeten wir die Wirkung von Heparin und des Fibrinolytikums Urokinase. Nach 24 Stunden reduzierten sowohl Heparin als auch Urokinase die Anzahl der arteriellen Verschlüsse signifikant. Niereninfarkt, Nierenverletzung, Infiltration von Neutrophilen, Gefäßverletzung sowie tubuläre Nekrose waren nahezu vollständig abwesend. Beide Behandlungen hatten im Vergleich zu mit Vehikel-behandelten Mäusen einen vollständigen Schutz vor GFR-Abfall. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nicht die Kristalle an sich, sondern die Kristallthrombosen arterielle Obstruktion, Gewebeinfarkt und Organversagen verursachen. Um die Bedeutung der ecDNA zu untersuchen, gaben wir rekombinante DNase I, die ecDNA degradiert. Tatsächlich war 24 h nach DNase I Gabe in den Arterien keine ecDNA mehr nachweisbar und, überraschenderweise, traten auch Kristallthrombosen nicht mehr auf. Die Verhinderung von arteriellen Verschlüssen war mit einem vollständigen Schutz vor GFR-Abfall, einer signifikanten Verringerung der Niereninfarktgröße verbunden. Somit ist ecDNA eine weitere nicht-redundante Komponente der CCE-bedingten arteriellen Obstruktion, des Gewebeinfarkts und des Organversagens. Da Herz- oder Aortenoperationen die Verwendung von Antikoagulanzien oder Fibrinolytika ausschließen, betrachteten wir rekombinante DNase I als mögliche Alternative zur Abschwächung der CC-Gerinnselbildung durch Hemmung der Fibrinbildung und der ecDNA-Akkumulation. Zuerst testeten wir das therapeutische Zeitfenster und stellten fest, dass die DNase I-Behandlung, die 3 Stunden nach der CCE verabreicht wurde, immer noch einen Trend zu verbesserten Ergebnissen im Vergleich zu 6 und 12 Stunden zeigte. Um die Ergebnisse bei der Einstellung einer CCE im Zusammenhang mit kardiovaskulären Eingriffen weiter zu optimieren, haben wir ein Regime getestet, das eine präventive Einzeldosis des Nekroptosehemmers Nec-1s mit therapeutischer Gabe von rekombinanter DNase 1 3 Stunden nach Kristallinjektion kombiniert. Hierunter kam es zu einer vollständigen Protektion von Kristallthrombosen Organversagen und Infarkt, was eine neue Behandlungsoption bei elektiven Eingriffen bei Hochrisikopatienten aufzeigen könnte. Mechanistische in vitro Untersuchungen im Organ-Chip Modell, zeigten wie Cholesterin-Kristalle zu Endothelschäden führen, dass ecDNA v.a. aus Endothel und Neutrophilen freigesetzt wird. Thrombozyten setzen nur wenig mitochondriale DNA frei. DNase I inhibiert die CC-induzierte Thrombozytenaktivierung, möglicherweise durch Abbau von ADP. Zusammengenommen präsentieren wir erstmals ein Mausmodell einer CCE mit Organversagen und Infarkt, das pathophysiologische Studien gestattet. Nicht der Infarkt an sich, sondern die Kristallthrombosen sind für das Organversagen entscheidend. Endothelschädigung mit Freisetzung von ecDNA und Plättchenaktivierung führen zur Bildung der Kristallthrombosen und bieten alte und neue Therapietargets. Eine prophylaktische Einmalgabe eines Zelltodinhibitors und die Gabe von DNase I im postinterventionellen Zeitfenster von 3 h (bei der Maus) könnten helfen, die Prognose von Patienten mit Prozedur-assoziierter CCE zu verbessern.

Abstract

Atherosclerosis is a leading cause of global morbidity and mortality. In advanced atherosclerosis, cholesterol crystal (CC) embolism (CCE) is a potentially life-threatening complication with an average mortality of 62.8 %. Autopsies or tissue biopsies reveal CC inside the arterial lumen surrounded by an undefined biological matrix obstructing the vessel lumen. Little is known about the precise cellular and molecular mechanisms following CCE, in part due to the lack of animal models. Therefore, I hypothesized that developing a reproducible mouse model of CCE to mimic the morphological and functional characteristics of CCE in humans would be instrumental to dissect the molecular mechanisms of CC-driven arterial occlusion, tissue infarction, and organ failure. To induce CCE, different doses of CC were injected into the left kidney artery of C57BL/6J mice. Acute kidney failure was evaluated by kidney function (i.e. GFR), kidney infarction was quantified using the TTC method. CC caused crystal clots occluding intrarenal arteries and a dose-dependent drop in GFR. In contrast, the extent of kidney infarction was more variable. 3D μCT showed partial and complete arterial occlusions, blood vessel rarefaction, and volume change. The macroscopic analysis revealed kidney swelling and territorial infarctions, tubular necrosis, interstitial edema, neutrophil infiltrates, and loss of CD31. Thus, intraarterial CC injection induces arterial occlusions causing acute territorial infarctions, perilesional inflammation, and organ failure. Blocking necroptosis with Mlkl-/- mice or Nec-1s, and the NLRP3 inhibitor significantly reduced infarct size, kidney injury, and neutrophil infiltration at 24 h compared to WT controls. However, none of these interventions affected CCE-related GFR loss. Consistently, necroinflammation is involved in kidney infarction but not in arterial occlusions as an upstream event. Thus, as nephron perfusion is ultimately required for kidney function, inhibiting infarction alone does not prevent acute kidney failure. Immunostaining revealed that crystal clots involved platelets, neutrophils, fibrin, and extracellular DNA (ecDNA). Therefore, I depleted neutrophils or inhibited NET formation before CC injection. Neutrophil depletion or NET inhibition significantly decreased kidney infarction compared to the control groups, but this had no significant effect on arterial obstructions or GFR loss, maybe because mononuclear cells had partially replaced neutrophils inside crystal clots as a source of ecDNA. In contrast, the platelet P2Y12 receptor antagonist clopidogrel completely protected mice from intravascular obstructions, GFR loss, kidney infarction, and perilesional neutrophil infiltrate. Therefore, CC occlude arteries by forming crystal clots consisting of fibrin, platelets, and neutrophils. Thus, platelets but not neutrophils are central for CCE-related arterial occlusion, organ failure, and tissue infarction. Next, I tested the effects of the anticoagulant heparin and the fibrinolytic agent urokinase. At 24h both heparin and urokinase significantly reduced the arterial occlusions number, kidney infarction, kidney injury, neutrophils infiltration, vascular injury as well as tubular necrosis. Both treatments had complete protection from GFR loss compared to vehicle-treated mice. Conclusively, not the crystals per se but rather crystal clots cause arterial obstruction, tissue infarction, and organ failure. In the DNase I treatment group, I noticed a significant reduction in the percentage of CC clots with ecDNA. After 24h of DNase I treatment intraarterial ecDNA had disappeared and the number of arterial occlusions was significantly reduced. Preventing arterial occlusions was associated with complete protection from GFR loss, a significant reduction in kidney infarct size as well as kidney cell death, neutrophil infiltrates, and vascular rarefaction. Thus, ecDNA is another non-redundant component of CCE-related arterial obstruction, tissue infarction, and organ failure. As cardiac or aorta surgeries preclude the use of anticoagulants or fibrinolytic agents, I considered recombinant DNase I as a possible alternative to attenuate CC clot formation by inhibiting fibrin formation and ecDNA accumulation. First, I tested the therapeutic window-of-opportunity and found that DNase I treatment given 3 h after CCE showed trends towards improved outcomes compared to 6 h and 12 h. To further optimize outcomes in the setting of a cardiovascular procedure-related CCE I tested a regimen combining a pre-emptive single dose of the necroptosis inhibitor Nec-1s with therapeutic recombinant DNase I gave 3 h after intraarterial CC injection. This approach could be feasible as prophylaxis given to all patients at risk, while DNase I would be only given to those with signs of CCE into the kidney, e.g. an early decline of urinary output. This dual strategy resulted in significant protection from GFR loss and kidney infarction in almost all animals together with a significant reduction in vascular occlusions by crystal clots. In my in vitro studies, platelets were exposed to thrombin with or without CC and found that CC enhances fibrinogen release from platelet alpha (α)-granules, which further promotes fibrin clot formation. CC exposure also induced ATP secretion from dense (δ)-granules, but co-incubation with DNase I strongly reduced these extracellular ATP releases. Next, I stimulated platelets with thrombin and collagen-related peptide and indicated DNase I can inhibit fibrinogen and ATP secretion and subsequent fibrin formation and P2Y12 receptor signaling, respectively. To model this process in vitro, I tested collagen-driven platelet aggregation with or without CC. Indeed, collagen I triggered massive platelet aggregation within 5 min with CC, DNase I treatment normalized this accelerated aggregation response. Endothelial cells and neutrophils studies showed that CC did not directly induce plasmatic coagulation but induced NET formation and DNA release mainly from kidney endothelial cells, neutrophils, and few from platelets. Thus, the in vitro studies support that CC and platelet dependent ecDNA release from neutrophils and endothelial cells, and DNase I can attenuate CC-induced platelet activation, aggregation, and fibrin clot formation. In summary, not CC by itself but the fibrin clots forming around CC obstruct peripheral arteries causing tissue infarction and organ failure. Hence, crystal clots represent the primary target for therapeutic interventions. Among the possible molecular targets in thrombosis and haemostasis, especially enhancing fibrinolysis or inhibiting platelet purinergic signaling could reduce arterial occlusions, infarction, and organ failure albeit with a relatively short window-of-opportunity up to 3 h. My results suggest that prophylactic necroptosis inhibition with a combination of DNase I therapy could have a synergistic effect on CC induced clot formation in mice and might be a feasible two-step prophylactic/therapeutic approach in human patients with a risk for procedure-related CCE.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Extracellular DNA, AKI, CCE, neutrophil, platelet, necroptosis, inflammasome, kidney infarction
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 20. April 2021
• 1. Bericht­erstatter:in: Anders, Hans-Joachim