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Untersuchung der Pharmakodynamik und Effektivität der präventiven BACE1‐Inhibierung gegen die Alzheimer Demenz unter Verwendung und Charakterisierung des APP‐Knock‐In Mausmodells
Untersuchung der Pharmakodynamik und Effektivität der präventiven BACE1‐Inhibierung gegen die Alzheimer Demenz unter Verwendung und Charakterisierung des APP‐Knock‐In Mausmodells
Die Alzheimer Demenz (AD) stellt im Zeitalter des demographischen Wandels global eine zunehmende medizinische, ökonomische und gesellschaftliche Herausforderung dar. Die Zahl der Betroffenen lag 2018 bei 50 Millionen Menschen weltweit, wobei sich diese Zahl laut Prognosen des „World Alzheimer Report 2018 “ bis 2050 verdreifachen wird. Die AD führt unter anderem zu einem progressiven Verlust kognitiver Funktionen und Gedächtnisleistungen sowie zu einer Atrophie bestimmter Hirnareale. Die Diagnoseverfahren zur Feststellung der chronischen, neurodegenerativen Erkrankung des zentralen Nervensystems werden stetig verbessert. Allerdings existieren derzeit weder präventive noch kurative Wirkstoffe, welche das Ausbrechen oder Fortschreiten der Krankheit unterbinden könnten. Einen Erklärungsansatz für die Entstehung der Alzheimer Demenz auf molekularer Ebene bietet die Amyloid‐Kaskaden‐Hypothese, welche als Ursache die Akkumulation und Aggregation des Amyloid‐Beta (Aβ)‐Peptids postuliert, wodurch fortführend Synapsen und Neurone geschädigt werden und degenerieren. Das Aβ‐Peptid entsteht durch die sequenzielle Spaltung des Amyloid‐Vorläufer‐Proteins (APP) durch die β‐Sekretase BACE1 und die γ‐Sekretase. In den letzten Jahrzehnten wurde deshalb intensiv die direkte Hemmung der BACE1‐Sekretase als Therapieansatz verfolgt, um eine Reduktion der Aβ‐Generierung zu bewirken. Äußerst wirksame, nicht‐peptidische BACE‐Inhibitoren wurden entwickelt und für klinische Studien zugelassen. Die klinischen Studien mussten allerdings aufgrund einer unzureichenden Wirkung des Inhibitors sowie infolge von Nebenwirkungen, wie der Verschlechterung der kognitiven Leistung, vorzeitig abgebrochen werden. Neuste Erkenntnisse legen die Vermutung nahe, dass eine therapeutische Intervention mittels BACE‐Inhibition in einem präklinischem AD‐Stadium und somit vor der Manifestierung klinischer Symptome erfolgen muss. Eine weitere Herausforderung wird es sein, eine ausgewogene BACE-Inhibitor Dosierung zu ermitteln, die Wirksamkeit und klinische Sicherheit gewährleistet. Im ersten Teil dieser Dissertation wurde der Verlauf und die Ausprägung der Pathologie des Knock‐In Alzheimer Mausmodells APPNL–G–F (APP‐Knock‐In) tiefergehend untersucht. Diese Untersuchung sollte klären, ob das APP‐Knock‐In Mausmodell ein frühes AD‐Stadium widerspiegelt und sich als Modell eignet, die Effektivität einer präventiven und ausgewogenen BACE‐Inhibitor Intervention zu ermitteln. Mittels Kleintier‐Positronen‐Emissions‐Tomographie (μPET) wurde eine parallele Zunahme der Aβ‐Last und der Neuroinflammation beobachtet. Die in vivo 2‐Photonen mikroskopischen Intervalluntersuchung dendritischer Spines des Stratum Oriens der CA1‐Region des Hippocampus zeigte eine Beeinträchtigung der strukturellen Plastizität der Postsynapsen abseits von Aβ‐Ablagerungen. Ein Rückgang in der Spine‐Dichte konnte allerdings nicht festgestellt werden. Diese Beobachtungen bieten einen möglichen Erklärungsansatz für die darüber hinaus observierten hippocampusabhängigen Lern‐ und Gedächtnisdefizite des APP‐Knock‐In Mausmodells im Morris‐Wasserlabyrinth. Zusammenfassend zeigten die Observierungen, dass das APP‐Knock‐In Mausmodell ein frühes Stadium der Alzheimer Demenz widerspiegelt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde anschließend die Effektivität einer präventiven BACE‐Inhibition mittels des potenten BACE‐Inhibitors NB‐360 im APP‐Knock‐In Mausmodell untersucht. Zunächst wurde eine NB‐360‐Dosierung ermittelt, welche eine signifikante Hemmung der AD‐Pathologie im APP‐Knock‐In Mausmodell bewirkte ohne gravierende Nebenwirkungen auszulösen. Mittels Intravitalmikroskopischen Untersuchungen konnte beobachtet werden, dass die im APP‐Knock‐In Mausmodell observierte Beeinträchtigung der strukturellen Plastizität dendritischer Spines des Stratum oriens der CA1‐Region des Hippocampus abseits von Aβ‐Ablagerungen unter der frühzeitigen Intervention mittels einer hohen NB‐360‐Dosierung behoben werden konnte. Im Wildtyp bewirkte die hohe Dosierung des BACE‐Inhibitors NB‐360 allerdings eine signifikante Abnahme in der Bildung neuer dendritischer Spines. Unter einer niedrig dosierten NB‐360‐Behandlung wurde im APPKnock‐In Mausmodell kein signifikanter Effekt auf die strukturelle Plastizität dendritischer Spines beobachtet. Im Wildtyp waren die Ergebnisse unter der niedrigen NB‐360‐Behandlung nicht ganz eindeutig. Der Therapieansatz einer präventiven BACE‐Inhibition bedingt zudem eine langfristige Verabreichung des Inhibitors, weshalb anschließend die Langzeitapplikation der hohen NB‐360‐Dosierung auf die Entwicklung der Aβ‐Last sowie auf die Neuroiflammation mittels μPET untersucht wurde. Unter der präventiven und langfristigen BACE‐Inhibitor Behandlung konnte eine signifikante Senkung der kortikalen Aβ‐Last sowie der hippocampalen und kortikalen Neuroinflammation im APP‐Knock‐In Mausmodell beobachtet werden. Darüber hinaus wurde eine signifikante Verbesserung der kognitiven Leistung unter der langfristigen BACE‐Inhibitor Behandlung mittels NB‐360 festgestellt. Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass die präventive BACE1‐Inhibition eine valide therapeutische Behandlung bei der Alzheimer Demenz darstellt ‐ Vorausgesetzt der Applikationszeitpunkt und die Dosierung des BACE1‐Inhibitors werden adäquat gewählt., In an age of demographic aging, Alzheimer’s dementia (AD) represents a global medical, economic and social challenge. In 2018, the number of people affected was 50 million worldwide and according to the World Alzheimer Report of 2018 this number will triple by 2050. AD is characterized by a progressive loss of cognitive functions as well as an atrophy of certain brain areas. Diagnostic procedures for detecting the chronic neurodegenerative disease of the central nervous system are constantly being improved. However, there are currently neither preventive nor curative therapeutic agents that could stop the onset or progression of the disease. An explanation for the development of Alzheimer’s dementia at the molecular level is provided by the amyloid‐cascade‐hypothesis, postulating the accumulation and aggregation of the amyloid‐beta (Aβ)‐peptide as the central pathogenic event, which is followed by synaptic and neuronal damage and degeneration. The Aβ‐peptide is produced by the sequential cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by the β‐secretase BACE1 followed by the γ‐secretase. Therefore, the direct inhibition of the BACE1‐secretase has been intensively pursued in the last decades as a therapeutic approach to reduce the generation of Aβ. Highly effective, non‐peptidic BACE‐inhibitors have been developed and approved for clinical trials. However, the clinical trials had to be terminated prematurely due to an insufficient effect of the inhibitor as well as side effects such as cognitive worsening. Recent findings suggest that a therapeutic intervention targeting BACE1‐inhibition must be performed at a preclinical AD‐stage and thus before the onset of clinical symptoms. A further challenge will be to find a suitable therapeutic dosage of a BACE1‐inhibitor that reconciles both: efficacy and clinical safety. In the first part of this thesis, the course of AD‐pathology expressed by the knock‐in mouse model APPNL–G–F(APP‐knock‐in) was investigated in detail. Based on this investigation the efficacy of preventive BACE‐inhibitor treatment in this AD mouse model was evaluated in the second part of this study. The longitudinally monitoring of amyloidogenesis and neuroinflammation using small animal positron‐emission‐tomography (μPET) revealed a parallel increase in Aβ‐load and neuroinflammation in APP‐knock‐In mice. Investigating the structural plasticity of dendritic spines in the Stratum oriens of the CA1‐region of the hippocampus by using 2‐photon in vivo microscopy, a significant reduction in the formation of new dendritic spines was observed in the distance of Aβ‐deposits. A decrease in Spine‐Density was not detected. The in vivo detected impairment of synaptic plasticity also offers a possible explanation for the further observed hippocampus‐dependent learning and memory deficits in the APP‐knock‐in mouse model using the Morris water maze test. In summary, the observations confirmed that the mouse model reflects an early stage of Alzheimer’s dementia. In the second part of this thesis, the effectiveness of a preventive BACE‐inhibitor treatment in the APP‐knock‐in mouse model was analyzed. First APP‐knock‐in mice were treated with two different dosages of the potent, blood‐brain barrier penetrating BACE‐inhibitor NB‐360 to determine which dose successfully inhibits the AD‐pathology without side effects. Using intravital microscopy, it was observed that the high dosage of NB‐360 enhanced significantly the initial reduced spine‐formation rate in APP‐knock‐in mice. In wild type mice, the higher dosage of NB‐360 resulted in a significant decrease in the formation of new dendritic spines. No significant effect on the structural plasticity of dendritic spines was observed in the APP‐knock‐in mouse model under low‐dose NB360‐treatment. In wild type mice, the results were not entirely clear under the low dose NB360‐treatment. The therapeutic approach of a preventive BACE‐inhibitor treatment also requires long‐term administration of such a therapeutic agent. Therefore, the effects of a preventive, long‐term BACE‐inhibitor intervention, with the therapeutically effective high dosage of NB‐360, were investigated by monitoring the course of amyloidogenesis and neuroinflammation using longitudinal μPET‐imaging. The therapeutical approach of a preventive, long‐term BACEinhibition with the higher dosed NB‐360‐Inhibitor was able to significantly reduce the cortical Aβ‐load as well as the hippocampal and cortical neuroinflammation in the APP‐knockin mouse model. In addition, a significant improvement in cognitive performance was observed under long‐term BACE inhibitor treatment with high dosed NB‐360. In summary, these data showed that preventive BACE1‐inhibition is a valid therapeutic treatment for Alzheimer’s dementia ‐ provided that the timing and dosage of the BACE1‐inhibitor are appropriately chosen.
Alzheimer Demenz, dendritische spines, in vivo 2-photonen Mikroskopie, Kleintier‐Positronen‐Emissions‐Tomographie, BACE1-Inhibition, APP knock-In, AppNL-G-F, NB-360, Neuroinflammation
Blume, Tanja
2021
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Blume, Tanja (2021): Untersuchung der Pharmakodynamik und Effektivität der präventiven BACE1‐Inhibierung gegen die Alzheimer Demenz unter Verwendung und Charakterisierung des APP‐Knock‐In Mausmodells. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Die Alzheimer Demenz (AD) stellt im Zeitalter des demographischen Wandels global eine zunehmende medizinische, ökonomische und gesellschaftliche Herausforderung dar. Die Zahl der Betroffenen lag 2018 bei 50 Millionen Menschen weltweit, wobei sich diese Zahl laut Prognosen des „World Alzheimer Report 2018 “ bis 2050 verdreifachen wird. Die AD führt unter anderem zu einem progressiven Verlust kognitiver Funktionen und Gedächtnisleistungen sowie zu einer Atrophie bestimmter Hirnareale. Die Diagnoseverfahren zur Feststellung der chronischen, neurodegenerativen Erkrankung des zentralen Nervensystems werden stetig verbessert. Allerdings existieren derzeit weder präventive noch kurative Wirkstoffe, welche das Ausbrechen oder Fortschreiten der Krankheit unterbinden könnten. Einen Erklärungsansatz für die Entstehung der Alzheimer Demenz auf molekularer Ebene bietet die Amyloid‐Kaskaden‐Hypothese, welche als Ursache die Akkumulation und Aggregation des Amyloid‐Beta (Aβ)‐Peptids postuliert, wodurch fortführend Synapsen und Neurone geschädigt werden und degenerieren. Das Aβ‐Peptid entsteht durch die sequenzielle Spaltung des Amyloid‐Vorläufer‐Proteins (APP) durch die β‐Sekretase BACE1 und die γ‐Sekretase. In den letzten Jahrzehnten wurde deshalb intensiv die direkte Hemmung der BACE1‐Sekretase als Therapieansatz verfolgt, um eine Reduktion der Aβ‐Generierung zu bewirken. Äußerst wirksame, nicht‐peptidische BACE‐Inhibitoren wurden entwickelt und für klinische Studien zugelassen. Die klinischen Studien mussten allerdings aufgrund einer unzureichenden Wirkung des Inhibitors sowie infolge von Nebenwirkungen, wie der Verschlechterung der kognitiven Leistung, vorzeitig abgebrochen werden. Neuste Erkenntnisse legen die Vermutung nahe, dass eine therapeutische Intervention mittels BACE‐Inhibition in einem präklinischem AD‐Stadium und somit vor der Manifestierung klinischer Symptome erfolgen muss. Eine weitere Herausforderung wird es sein, eine ausgewogene BACE-Inhibitor Dosierung zu ermitteln, die Wirksamkeit und klinische Sicherheit gewährleistet. Im ersten Teil dieser Dissertation wurde der Verlauf und die Ausprägung der Pathologie des Knock‐In Alzheimer Mausmodells APPNL–G–F (APP‐Knock‐In) tiefergehend untersucht. Diese Untersuchung sollte klären, ob das APP‐Knock‐In Mausmodell ein frühes AD‐Stadium widerspiegelt und sich als Modell eignet, die Effektivität einer präventiven und ausgewogenen BACE‐Inhibitor Intervention zu ermitteln. Mittels Kleintier‐Positronen‐Emissions‐Tomographie (μPET) wurde eine parallele Zunahme der Aβ‐Last und der Neuroinflammation beobachtet. Die in vivo 2‐Photonen mikroskopischen Intervalluntersuchung dendritischer Spines des Stratum Oriens der CA1‐Region des Hippocampus zeigte eine Beeinträchtigung der strukturellen Plastizität der Postsynapsen abseits von Aβ‐Ablagerungen. Ein Rückgang in der Spine‐Dichte konnte allerdings nicht festgestellt werden. Diese Beobachtungen bieten einen möglichen Erklärungsansatz für die darüber hinaus observierten hippocampusabhängigen Lern‐ und Gedächtnisdefizite des APP‐Knock‐In Mausmodells im Morris‐Wasserlabyrinth. Zusammenfassend zeigten die Observierungen, dass das APP‐Knock‐In Mausmodell ein frühes Stadium der Alzheimer Demenz widerspiegelt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde anschließend die Effektivität einer präventiven BACE‐Inhibition mittels des potenten BACE‐Inhibitors NB‐360 im APP‐Knock‐In Mausmodell untersucht. Zunächst wurde eine NB‐360‐Dosierung ermittelt, welche eine signifikante Hemmung der AD‐Pathologie im APP‐Knock‐In Mausmodell bewirkte ohne gravierende Nebenwirkungen auszulösen. Mittels Intravitalmikroskopischen Untersuchungen konnte beobachtet werden, dass die im APP‐Knock‐In Mausmodell observierte Beeinträchtigung der strukturellen Plastizität dendritischer Spines des Stratum oriens der CA1‐Region des Hippocampus abseits von Aβ‐Ablagerungen unter der frühzeitigen Intervention mittels einer hohen NB‐360‐Dosierung behoben werden konnte. Im Wildtyp bewirkte die hohe Dosierung des BACE‐Inhibitors NB‐360 allerdings eine signifikante Abnahme in der Bildung neuer dendritischer Spines. Unter einer niedrig dosierten NB‐360‐Behandlung wurde im APPKnock‐In Mausmodell kein signifikanter Effekt auf die strukturelle Plastizität dendritischer Spines beobachtet. Im Wildtyp waren die Ergebnisse unter der niedrigen NB‐360‐Behandlung nicht ganz eindeutig. Der Therapieansatz einer präventiven BACE‐Inhibition bedingt zudem eine langfristige Verabreichung des Inhibitors, weshalb anschließend die Langzeitapplikation der hohen NB‐360‐Dosierung auf die Entwicklung der Aβ‐Last sowie auf die Neuroiflammation mittels μPET untersucht wurde. Unter der präventiven und langfristigen BACE‐Inhibitor Behandlung konnte eine signifikante Senkung der kortikalen Aβ‐Last sowie der hippocampalen und kortikalen Neuroinflammation im APP‐Knock‐In Mausmodell beobachtet werden. Darüber hinaus wurde eine signifikante Verbesserung der kognitiven Leistung unter der langfristigen BACE‐Inhibitor Behandlung mittels NB‐360 festgestellt. Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass die präventive BACE1‐Inhibition eine valide therapeutische Behandlung bei der Alzheimer Demenz darstellt ‐ Vorausgesetzt der Applikationszeitpunkt und die Dosierung des BACE1‐Inhibitors werden adäquat gewählt.

Abstract

In an age of demographic aging, Alzheimer’s dementia (AD) represents a global medical, economic and social challenge. In 2018, the number of people affected was 50 million worldwide and according to the World Alzheimer Report of 2018 this number will triple by 2050. AD is characterized by a progressive loss of cognitive functions as well as an atrophy of certain brain areas. Diagnostic procedures for detecting the chronic neurodegenerative disease of the central nervous system are constantly being improved. However, there are currently neither preventive nor curative therapeutic agents that could stop the onset or progression of the disease. An explanation for the development of Alzheimer’s dementia at the molecular level is provided by the amyloid‐cascade‐hypothesis, postulating the accumulation and aggregation of the amyloid‐beta (Aβ)‐peptide as the central pathogenic event, which is followed by synaptic and neuronal damage and degeneration. The Aβ‐peptide is produced by the sequential cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by the β‐secretase BACE1 followed by the γ‐secretase. Therefore, the direct inhibition of the BACE1‐secretase has been intensively pursued in the last decades as a therapeutic approach to reduce the generation of Aβ. Highly effective, non‐peptidic BACE‐inhibitors have been developed and approved for clinical trials. However, the clinical trials had to be terminated prematurely due to an insufficient effect of the inhibitor as well as side effects such as cognitive worsening. Recent findings suggest that a therapeutic intervention targeting BACE1‐inhibition must be performed at a preclinical AD‐stage and thus before the onset of clinical symptoms. A further challenge will be to find a suitable therapeutic dosage of a BACE1‐inhibitor that reconciles both: efficacy and clinical safety. In the first part of this thesis, the course of AD‐pathology expressed by the knock‐in mouse model APPNL–G–F(APP‐knock‐in) was investigated in detail. Based on this investigation the efficacy of preventive BACE‐inhibitor treatment in this AD mouse model was evaluated in the second part of this study. The longitudinally monitoring of amyloidogenesis and neuroinflammation using small animal positron‐emission‐tomography (μPET) revealed a parallel increase in Aβ‐load and neuroinflammation in APP‐knock‐In mice. Investigating the structural plasticity of dendritic spines in the Stratum oriens of the CA1‐region of the hippocampus by using 2‐photon in vivo microscopy, a significant reduction in the formation of new dendritic spines was observed in the distance of Aβ‐deposits. A decrease in Spine‐Density was not detected. The in vivo detected impairment of synaptic plasticity also offers a possible explanation for the further observed hippocampus‐dependent learning and memory deficits in the APP‐knock‐in mouse model using the Morris water maze test. In summary, the observations confirmed that the mouse model reflects an early stage of Alzheimer’s dementia. In the second part of this thesis, the effectiveness of a preventive BACE‐inhibitor treatment in the APP‐knock‐in mouse model was analyzed. First APP‐knock‐in mice were treated with two different dosages of the potent, blood‐brain barrier penetrating BACE‐inhibitor NB‐360 to determine which dose successfully inhibits the AD‐pathology without side effects. Using intravital microscopy, it was observed that the high dosage of NB‐360 enhanced significantly the initial reduced spine‐formation rate in APP‐knock‐in mice. In wild type mice, the higher dosage of NB‐360 resulted in a significant decrease in the formation of new dendritic spines. No significant effect on the structural plasticity of dendritic spines was observed in the APP‐knock‐in mouse model under low‐dose NB360‐treatment. In wild type mice, the results were not entirely clear under the low dose NB360‐treatment. The therapeutic approach of a preventive BACE‐inhibitor treatment also requires long‐term administration of such a therapeutic agent. Therefore, the effects of a preventive, long‐term BACE‐inhibitor intervention, with the therapeutically effective high dosage of NB‐360, were investigated by monitoring the course of amyloidogenesis and neuroinflammation using longitudinal μPET‐imaging. The therapeutical approach of a preventive, long‐term BACEinhibition with the higher dosed NB‐360‐Inhibitor was able to significantly reduce the cortical Aβ‐load as well as the hippocampal and cortical neuroinflammation in the APP‐knockin mouse model. In addition, a significant improvement in cognitive performance was observed under long‐term BACE inhibitor treatment with high dosed NB‐360. In summary, these data showed that preventive BACE1‐inhibition is a valid therapeutic treatment for Alzheimer’s dementia ‐ provided that the timing and dosage of the BACE1‐inhibitor are appropriately chosen.