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Evaluation einer neuartigen Zellquelle im kardiovaskulären Tissue Engineering – Die Herz-Lungen-Maschine
Evaluation einer neuartigen Zellquelle im kardiovaskulären Tissue Engineering – Die Herz-Lungen-Maschine
Introduction ncreasing life expectancy leads to a rising number of degenerative heart valve diseases. In an advanced stage of the disease heart valve replacement ist the only curative therapy. Conventional heart valve prostheses are mechanical or biological. The main disadvantages of those prostheses are lack of growth potential, required anticoagulation in case of a mechanical valve or the limited durability of a biological valve. Tissue engineered heart valves consist of autologous fibroblasts (FB) and endothelial cells (EC). Ideally combining growth, self-regeneration and no immunological response. A postoperative cell isolation from heart-lung machines (HLM) was established in a previous work. This method was further optimized for a more profitable cell harvest. Additionaly those cells were analyzed regarding their attributes and suitability for the engineering of autologous heart valve prosthesis and compared with vascular EC and FB as a control group. Methods For cell isolation 20 dual-chamber reservoirs of HLM were used postoperatively. After rinsing the filters of the heart-lung machine in the blood of the reservoir a mononuclear cell fraction could be seperated via density gradient centrifugation. The cell fraction was split and cultivated in either EC-GM (growth medium) or FB-GM. Additionaly fine pored filters from the HLM were cut up and cultivated in FB-GM. Cultivated cells were analyzed for rate of prolifertaion via WST assay (after 24 h, 48 h and 72 h). Additionaly cells were immunhistochemically examined for expression of EC markers (PECAM, vWF, VE-cadherin), FB markers (TE-7) as well as antibodies staining muscle tissue (SMC myosin, myosin heavy chain) and α-actin as cytoskeletal marker. Furthermore stem cell markers CD 45, CD 73, CD 90 and CD 105 were analyzed by immunofluorescence. Ultimately 15 EC lines were cultivated while experiencing up to 20 dyn/cm2 unidirectional shear stress for 24 h. For comparison those cell lines were stained by immunofluorescence for VE-cadherin and Sir-actin. Results A total of 41 cell lines were obtained. 28 from cultivating the mononuclear cell fraction (15 cell lines cultured in EC-GM and 13 cell lines cultured in FB-GM) as well as 13 cell lines from cultivation of filters in FB-GM. Concluding in a successful cell isolation in 17 out of 20 reservoirs of HLM. Measured via WST assay both cell types isolated from the HLM showed a higher proliferation than vascular EC and FB. By immunohistochemistry 23 cell lines showed expression of EC markers, 4 cell lines stained positive for FB markers and 14 cell lines were positive for both type of markers. Stem cell staining was negative. EC cultured under shear stress showed a typical behavior. Alignement of the cells as well as the intracellular actin was observed to be in the direction of the flow. Additionally a higher proliferation rate and an increase of cell-cell contacts was shown. Summary With a successfull cell isolation in 17 out of 20 reservoirs, the HLM proved to be a reliable source for cell harvesting. It was also shown that these cells were suitable for tissue engineered heart valves. In particular, those cells had a higher proliferation rate compared to cells from vascular origin thus having a smaller time span to serve the high number of cells needed for tissue engineered heart valves. The isolated EC were also able to adapt to external influences such as the shear stress in flow cultivation., Einleitung Als Konsequenz einer kontinuierlich weiter steigenden Lebenserwartung in Deutschland, stieg in den vergangenen Jahren die Prävalenz von erworbenen Klappenerkrankungen. Diese können im Endstadium nur durch einen Herzklappenersatz kurativ behandelt werden. Herkömmliche Herzklappenprothesen sind mechanischer oder biologischer Entität. Beim Einsatz mechanischer Herzklappen birgt die erforderliche Antikoagulation ein erhöhtes Blutungsrisiko. Biologische Herzklappen zeichnen sich leider durch eine beschränkte Haltbarkeit aus. Beide Herzklappenprothesen weisen ein fehlendes Wachstumspotenzial auf. Tissue-engineerte Herzklappen bestehen aus autologen vitalen Fibroblasten (FB) und Endothelzellen (EC) und sind deshalb fähig zu wachsen, selbstregenerierend und es kommt nach der Implantation zu keiner Immunreaktion. In einer vorangehenden Arbeit konnte die Methodik der Zellgewinnung postoperativ aus Herz-Lungen-Maschinen erarbeitet werden. In dieser Doktorarbeit wird die erweiterte Evaluation jener Zellen und deren Eignung zur Verwendung bei der Herstellung von Herzklappen überprüft. Methoden Zur Gewinnung der Zellen wurden postoperativ 20 Zweikammer-Reservoire der Herz-Lungen-Maschine für die Weiterverarbeitung verwendet. Mittels Dichtegradienten-Zentrifugation konnte das im Reservoir verbliebene Blut und die Rückstände der Filter in die mononukleäre Zellfraktion separiert werden. Ein Anteil dieser Fraktion wurde mit EC-GM (Wachstumsmedium), der andere mit FB-GM kultiviert. Zudem wurden die feinporigen Filter des Reservoirs in Rechtecke geschnitten und in Petrischalen mit FB-GM kultiviert. Die gewonnen Zellen wurden mittels WST-Assay nach 24h, 48h und 72h auf ihr Proliferationsverhalten untersucht. Bei der Immunhistochemie wurden die EC-Marker vWF, VE-Cadherin und PECAM; FB-Marker TE-7; Muskelmarker SMC-Myosin, Myosin heavy chain; Zytoskelettmarker α-Actin sowie der Zellkernmarker DAPI verwendet. Die Stammzellmarker CD 45, CD 73, CD 90 und CD 105 wurden mittels Immunfluoreszenz untersucht. 15 EC-Linien wurden in einem Flussversuch über 24h unter steigender unidirektionaler Scherspannung bis 20 dyn/cm2 kultiviert und anschließend per Immunfluoreszenz auf VE-Cadherin, Sir-Aktin und DAPI angefärbt. Ergebnisse Aus der mononukleären Zellfraktion konnten insgesamt 28 Zelllinien gewonnen werden. Durch Kultivierung der Zellfraktion in EC-GM wurden 15 Zelllinien, in FB-GM 13 Zelllinien gewonnen. Aus den Filtern, welche in Petrischalen in FB-GM kulitivert wurden, konnten 13 Zelllinien gewonnen werden. Zusammenfassend konnten so aus 17 von 20 HLM erfolgreich Zellen gewonnen werden. Der WST-Assay zeigte eine signifikant höhere Wachstumskurve für Endothelzellen und Fibroblasten verglichen mit Kontrollproben vaskulär gewonnener EC und FB. In der Immunzytologie färbten sich in 23 Zelllinien die Zellen mit EC-Markern, in 4 Zelllinien mit FB-Markern sowie in 14 Zelllinien mit beiden Markern, im Sinne einer Kokultur. Die Stammzellfärbung war negativ, kein Marker konnte nachgewiesen werden. Unter Fluss verhielten sich die EC charakteristisch: Es kam zur Ausrichtung der Zellen und des Aktins parallel zum Fluss, Zellproliferation und Zunahme der Zell-Zell-Kontakte. Zusammenfassung Die Herz-Lungen-Maschinen stellten sich mit 17/20 erfolgreichen Isolationen als zuverlässige Quelle zur Gewinnung von Zellen dar. Ebenso konnte das Potenzial dieser Zellen zur Weiterverarbeitung im Tissue-Engineering von Herzklappen aufgezeigt werden. In der Proliferationsrate zeigten sich die Zellen denen vaskulären Ursprungs als überlegen. Die erhöhte Wachstumsrate ermöglicht die schnelle Kultivierung einer ausreichenden Zellzahl für die Besiedelung der TEHV. Zudem adaptierten sich die EC unter Fluss an die externen Einflüsse, wie es auch bei EC in vivo der Fall ist.
Tissue Engineering, Herzlklappe, Endothelzellen, Fibroblasten, Herz-Lungen-Maschine
Schwender, Hannah
2021
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Schwender, Hannah (2021): Evaluation einer neuartigen Zellquelle im kardiovaskulären Tissue Engineering – Die Herz-Lungen-Maschine. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Introduction ncreasing life expectancy leads to a rising number of degenerative heart valve diseases. In an advanced stage of the disease heart valve replacement ist the only curative therapy. Conventional heart valve prostheses are mechanical or biological. The main disadvantages of those prostheses are lack of growth potential, required anticoagulation in case of a mechanical valve or the limited durability of a biological valve. Tissue engineered heart valves consist of autologous fibroblasts (FB) and endothelial cells (EC). Ideally combining growth, self-regeneration and no immunological response. A postoperative cell isolation from heart-lung machines (HLM) was established in a previous work. This method was further optimized for a more profitable cell harvest. Additionaly those cells were analyzed regarding their attributes and suitability for the engineering of autologous heart valve prosthesis and compared with vascular EC and FB as a control group. Methods For cell isolation 20 dual-chamber reservoirs of HLM were used postoperatively. After rinsing the filters of the heart-lung machine in the blood of the reservoir a mononuclear cell fraction could be seperated via density gradient centrifugation. The cell fraction was split and cultivated in either EC-GM (growth medium) or FB-GM. Additionaly fine pored filters from the HLM were cut up and cultivated in FB-GM. Cultivated cells were analyzed for rate of prolifertaion via WST assay (after 24 h, 48 h and 72 h). Additionaly cells were immunhistochemically examined for expression of EC markers (PECAM, vWF, VE-cadherin), FB markers (TE-7) as well as antibodies staining muscle tissue (SMC myosin, myosin heavy chain) and α-actin as cytoskeletal marker. Furthermore stem cell markers CD 45, CD 73, CD 90 and CD 105 were analyzed by immunofluorescence. Ultimately 15 EC lines were cultivated while experiencing up to 20 dyn/cm2 unidirectional shear stress for 24 h. For comparison those cell lines were stained by immunofluorescence for VE-cadherin and Sir-actin. Results A total of 41 cell lines were obtained. 28 from cultivating the mononuclear cell fraction (15 cell lines cultured in EC-GM and 13 cell lines cultured in FB-GM) as well as 13 cell lines from cultivation of filters in FB-GM. Concluding in a successful cell isolation in 17 out of 20 reservoirs of HLM. Measured via WST assay both cell types isolated from the HLM showed a higher proliferation than vascular EC and FB. By immunohistochemistry 23 cell lines showed expression of EC markers, 4 cell lines stained positive for FB markers and 14 cell lines were positive for both type of markers. Stem cell staining was negative. EC cultured under shear stress showed a typical behavior. Alignement of the cells as well as the intracellular actin was observed to be in the direction of the flow. Additionally a higher proliferation rate and an increase of cell-cell contacts was shown. Summary With a successfull cell isolation in 17 out of 20 reservoirs, the HLM proved to be a reliable source for cell harvesting. It was also shown that these cells were suitable for tissue engineered heart valves. In particular, those cells had a higher proliferation rate compared to cells from vascular origin thus having a smaller time span to serve the high number of cells needed for tissue engineered heart valves. The isolated EC were also able to adapt to external influences such as the shear stress in flow cultivation.

Abstract

Einleitung Als Konsequenz einer kontinuierlich weiter steigenden Lebenserwartung in Deutschland, stieg in den vergangenen Jahren die Prävalenz von erworbenen Klappenerkrankungen. Diese können im Endstadium nur durch einen Herzklappenersatz kurativ behandelt werden. Herkömmliche Herzklappenprothesen sind mechanischer oder biologischer Entität. Beim Einsatz mechanischer Herzklappen birgt die erforderliche Antikoagulation ein erhöhtes Blutungsrisiko. Biologische Herzklappen zeichnen sich leider durch eine beschränkte Haltbarkeit aus. Beide Herzklappenprothesen weisen ein fehlendes Wachstumspotenzial auf. Tissue-engineerte Herzklappen bestehen aus autologen vitalen Fibroblasten (FB) und Endothelzellen (EC) und sind deshalb fähig zu wachsen, selbstregenerierend und es kommt nach der Implantation zu keiner Immunreaktion. In einer vorangehenden Arbeit konnte die Methodik der Zellgewinnung postoperativ aus Herz-Lungen-Maschinen erarbeitet werden. In dieser Doktorarbeit wird die erweiterte Evaluation jener Zellen und deren Eignung zur Verwendung bei der Herstellung von Herzklappen überprüft. Methoden Zur Gewinnung der Zellen wurden postoperativ 20 Zweikammer-Reservoire der Herz-Lungen-Maschine für die Weiterverarbeitung verwendet. Mittels Dichtegradienten-Zentrifugation konnte das im Reservoir verbliebene Blut und die Rückstände der Filter in die mononukleäre Zellfraktion separiert werden. Ein Anteil dieser Fraktion wurde mit EC-GM (Wachstumsmedium), der andere mit FB-GM kultiviert. Zudem wurden die feinporigen Filter des Reservoirs in Rechtecke geschnitten und in Petrischalen mit FB-GM kultiviert. Die gewonnen Zellen wurden mittels WST-Assay nach 24h, 48h und 72h auf ihr Proliferationsverhalten untersucht. Bei der Immunhistochemie wurden die EC-Marker vWF, VE-Cadherin und PECAM; FB-Marker TE-7; Muskelmarker SMC-Myosin, Myosin heavy chain; Zytoskelettmarker α-Actin sowie der Zellkernmarker DAPI verwendet. Die Stammzellmarker CD 45, CD 73, CD 90 und CD 105 wurden mittels Immunfluoreszenz untersucht. 15 EC-Linien wurden in einem Flussversuch über 24h unter steigender unidirektionaler Scherspannung bis 20 dyn/cm2 kultiviert und anschließend per Immunfluoreszenz auf VE-Cadherin, Sir-Aktin und DAPI angefärbt. Ergebnisse Aus der mononukleären Zellfraktion konnten insgesamt 28 Zelllinien gewonnen werden. Durch Kultivierung der Zellfraktion in EC-GM wurden 15 Zelllinien, in FB-GM 13 Zelllinien gewonnen. Aus den Filtern, welche in Petrischalen in FB-GM kulitivert wurden, konnten 13 Zelllinien gewonnen werden. Zusammenfassend konnten so aus 17 von 20 HLM erfolgreich Zellen gewonnen werden. Der WST-Assay zeigte eine signifikant höhere Wachstumskurve für Endothelzellen und Fibroblasten verglichen mit Kontrollproben vaskulär gewonnener EC und FB. In der Immunzytologie färbten sich in 23 Zelllinien die Zellen mit EC-Markern, in 4 Zelllinien mit FB-Markern sowie in 14 Zelllinien mit beiden Markern, im Sinne einer Kokultur. Die Stammzellfärbung war negativ, kein Marker konnte nachgewiesen werden. Unter Fluss verhielten sich die EC charakteristisch: Es kam zur Ausrichtung der Zellen und des Aktins parallel zum Fluss, Zellproliferation und Zunahme der Zell-Zell-Kontakte. Zusammenfassung Die Herz-Lungen-Maschinen stellten sich mit 17/20 erfolgreichen Isolationen als zuverlässige Quelle zur Gewinnung von Zellen dar. Ebenso konnte das Potenzial dieser Zellen zur Weiterverarbeitung im Tissue-Engineering von Herzklappen aufgezeigt werden. In der Proliferationsrate zeigten sich die Zellen denen vaskulären Ursprungs als überlegen. Die erhöhte Wachstumsrate ermöglicht die schnelle Kultivierung einer ausreichenden Zellzahl für die Besiedelung der TEHV. Zudem adaptierten sich die EC unter Fluss an die externen Einflüsse, wie es auch bei EC in vivo der Fall ist.